一种负载癌胚抗原的dc细胞及一种dc细胞肿瘤疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种负载癌胚抗原的DC细胞及一种DC 细胞肿瘤疫苗。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。好发部位为直肠及 直肠与乙状结肠交界处，占 60%。发病多在40岁以后，男女之比为2:1。结直肠癌的治疗 主要为以下三种方式：一是手术治疗，手术性治疗是结直肠癌根治性治疗的基础。二是综 合治疗，即手术联合化学药物进行治疗，且在手术后进行辅助放射治疗。三是放射治疗，对 晚期直肠癌患者、局部肿瘤浸润者、有外科禁忌证者，采用姑息性放疗，以缓解症状，减轻痛 苦。除了手术、放疗和化疗之外还有第四类肿瘤治疗，即为肿瘤免疫治疗。包括DC细胞肿 瘤疫苗治疗。DC疫苗以诱导和增强DC细胞这种强免疫特性为出发点，重新激活人体内免疫 应答机制，彻底修复人体免疫机制，故找到一种高效的DC疫苗的制备方法是十分必要的。
[0003] 树突状细胞（Dendriticcells，DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞 (Antigenpresentingcell，APC)，能够刺激初始的T细胞增殖，启动免疫应答；还能够呈递 抗原给MHC-I类限制性⑶8+和MHC-II类限制性⑶4+T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被 称为"天然免疫佐剂"，因此在诱导免疫应答中具有独特的地位。近年来，以DC为基础的免 疫治疗在临床应用中得到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点。
[0004] 在1965年Gold和Freedmen从结肠癌组织中发现癌胚抗原（CEA)，CEA是一种多 糖蛋白复合物，其分子量为150~300KD，其中45%为蛋白质。CEA由位于19号染色体的基 因所编码，可由胎儿胃肠道生僻组织、胰和肝的细胞合成，在妊娠前6个月内CEA含量在增 高，出生后血清中含量已很低下，健康成年人血清中CEA浓度小于2. 5 μ g/L，在一些恶性肿 瘤，如结肠癌、直肠癌和胃肠道癌等常见癌症病人的血清中，其浓度均有上升，吸毒、吸烟严 重者也可升高，但升高不明显。在临床上，若检测到血清中CEA的浓度大于20 μ g/L，则怀 疑已得肿瘤；CEA的浓度大于60 μ g/L时，可见结肠癌、直肠癌、胃癌和肺癌。故检测血清中 CEA的含量，可有助于结直肠癌的诊断。
[0005] 随着研究的深入，还有更多的抗原蛋白在癌症组织中被发现。但现有的树突状细 胞体外负载的抗原主要是肿瘤细胞株裂解物。肿瘤细胞株在体外传代过程中表面抗原可能 发生改变，制得疫苗的特异性不强，且制得DC细胞的增殖效果较弱。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种负载癌胚抗原的DC细胞及一 种DC细胞肿瘤疫苗，其DC细胞的增殖效果更好，疫苗的特异性增强，对肿瘤细胞的杀伤效 果提尚。
[0007] 本发明提供的负载癌胚抗原的DC细胞制备方法，包括：
[0008] 步骤1 :分离自外周血中⑶14+细胞；
[0009] 步骤2 :使CD 14+细胞分化为DC细胞；
[0010] 步骤3 :分离癌症患者血浆中分子量为60kDa~300kDa的蛋白；
[0011] 步骤4 :以分子量为60kDa~300kDa的蛋白刺激所述DC细胞，制得负载癌胚抗原 的DC细胞。
[0012] 采用超滤的方式分离癌症患者血浆中分子量为60kDa~300kDa的蛋白。具体为， 首先截留癌症患者的血浆中分子量小于300kDa的分子，经浓缩后，弃除分子量小于60kDa 的蛋白，即获得该蛋白。
[0013] 再整患者血浆中分子量为60kDa~300kDa的蛋白主要包括CEA。
[0014] 经两次超滤后，蛋白的浓度为3. 12mg/mL。
[0015] 作为优选，癌症患者的血浆为自体血浆。
[0016] 与健康人或其他癌症患者相比，癌症患者血浆中一些特殊的蛋白表达量增高，本 发明将这些蛋白富集并将它们负载在DC细胞上制备疫苗。
[0017] 作为优选，癌症患者为消化道癌症患者或呼吸道癌症患者。
[0018] 优选的，癌症患者为结直肠癌患者。
[0019] 在本发明的实施例中，步骤4中刺激所用分子量为60kDa~300kDa的蛋白浓度为 50 μ g/mL ~60 μ g/mL〇
[0020] 在本发明的实施例中，步骤4中刺激的时间为48h。
[0021] 本发明以来自癌症患者血浆的分子量为60kDa~300kDa的蛋白刺激DC细胞成 熟。该蛋白主要包括CEA。以该蛋白刺激后的DC细胞增殖能力较好，细胞中CD86+的表达 率较高。
[0022] 在本发明的实施例中，步骤1中分离采用磁珠法。
[0023] 在一些实施例中，磁珠法分离⑶14+细胞具体为：分离外周血中的单个核细胞后， 以磁珠法分离⑶14+细胞。
[0024] 作为优选，分离⑶14+细胞的外周血为自体外周血。
[0025] 在本发明的实施例中，步骤2中分化的诱导剂为GM-CSF和IL-4。
[0026] 在一些实施例中，诱导⑶14+细胞分化的GM-CSF的剂量为500~1000U/mL ;IL-4 的剂量为500~1000U/mL。
[0027] 在一些实施例中，诱导⑶14+细胞分化的培养基为X-VIV0 15培养基。
[0028] 在一些实施例中，诱导⑶14+细胞分化的时间为6-8天。
[0029] 在一些实施例中，诱导⑶14+细胞分化的条件为37°C，5% C02，饱和湿度。
[0030] 本发明提供方法制备的负载癌胚抗原的DC细胞。
[0031] 以本发明提供方法制备的负载癌胚抗原的DC细胞制备疫苗对SW620细胞、HCT116 细胞和HT-29细胞的杀伤活性较高。
[0032] 本发明还提供了一种DC细胞肿瘤疫苗，包括本发明提供方法制备的负载癌胚抗 原的DC细胞。
[0033] 在本发明的实施例中，本发明提供的DC细胞肿瘤疫苗还包括生理盐水和BSA。
[0034] 将本发明提供的负载癌胚抗原的DC细胞以生理盐水重悬后，加入BSA防止细胞集 聚成团，即可获得DC细胞肿瘤疫苗。
[0035] 本发明提供的DC细胞肿瘤疫苗中，负载癌胚抗原的DC细胞的密度为2-5X 105/ ml，BSA的浓度为2-5%。
[0036] 本发明提供的DC细胞肿瘤疫苗作为治疗癌症的药物的应用。
[0037] 该疫苗能够治疗的癌症为消化道癌症或呼吸道癌症。
[0038] 作为优选，消化道癌症为结直肠癌。
[0039] 本发明实验证明，以SW620细胞、HCT116细胞和HT-29细胞为靶细胞，将本发明提 供的负载癌胚抗原的DC细胞与CIK细胞共培养后获得效应细胞。将效应细胞与靶细胞混 合培养计算杀伤率。结果显示，与现有技术培养获得的负载癌胚抗原的DC细胞相比，本发 明提供的DC细胞能够更有效的杀伤靶细胞，杀伤率可达48%。
[0040] 在本发明的实施例中，靶效比为40:1~10:1。
[0041] 本发明通过超滤富集癌症患者血浆中分子量为60kDa~300kDa的蛋白，该蛋白中 主要包括CEA ;将该蛋白用于刺激DC细胞成熟，使DC细胞负载癌胚抗原，负载癌胚抗原后 的DC细胞增殖效果更好，且能够刺激CIK细胞对结直肠癌细胞株产生杀伤作用，且该效果 优于现有技术制备的DC细胞肿瘤疫苗。因此，本发明提供方法制备的负载癌胚抗原的DC 细胞能够制备肿瘤疫苗用于治疗癌症，特别是结直肠癌。
【附图说明】
[0042] 图1示实施例4和对比例1的获得细胞的增殖曲线，其中，·、、、?、、、示实施例4获得 细胞的增殖曲线示对比例1获得细胞的增殖曲线；
[0043] 图2示实施例4和对比例1的细胞标志物表达率，其中，图2-a示实施例4的获得 细胞的标志物表达率，其中，图2-b示对比例1的获得细胞的标志物表达率。
【具体实施方式】
[0044] 本发明提供了一种负载癌胚抗原的DC细胞及一种DC细胞肿瘤疫苗，本领域技术 人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改 动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应 用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内 对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0045] 本发明采用的细胞、试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0046] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0047] 实施例1⑶14+细胞的分离
[0048] 1、取结直肠癌患者的外周血，将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400~500g 离心5~lOmin，离心结束后将上层血浆收集于另一支离心管中，用于实施例3。
[0049] 2、将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释。
[0050] 3、另取一支新的sepmate离心管（购自STEM CELL公司），加入Ficoll淋巴细胞分 离液（购自STEM CELL公司）12ml，将稀释后的血细胞转移到s印mate离心管，600~800g 离心15~20min。
[0051] 4、离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次。
[0052] 5、用CD 14+分选试剂盒（购自STEM CELL公司）将CD 14+细胞从上述单个核细胞 中分选出来。
[0053] 6、用X-VIVO 15培养基重悬细胞，加入500~lOOOU/ml的GM-CSF溶液、500~ 1000U/ml的IL-4溶液和一定量的自体血浆，将CD14+细胞培养在T25培养瓶中。
[0054] 实施例2⑶14+细胞的诱导
[0055] 用X-VIV0 15培养基重悬实施例1制得的⑶14+细胞至细胞密度为2-5 X 105/ml。 加入500~1000U/ml的GM-CSF溶液、500~1000U/