一种抑制Bid蛋白表达的miR-29a模拟物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种抑制Bid蛋白表达的miR-29a模拟 物及其应用。
【背景技术】
[0002] HIV-1病毒感染可导致⑶4+T细胞中的miR-29水平严重下降，因 此miR-29被认为是HIV-1进展性感染的生物标志（Nucleic Acids Res. 2012 ; 40:2181-2196, Retrovirology 2012 ;9:5)。研究发现 miR-29 能抑制 HIV-1 病毒在细胞内 的复制和感染活性，其可能机制包括:miR-29能结合HIV-lmRNA的3'非编码区，促使mRNA 靶向到P body进行降解，HIV 3' UTR区中miR-29a的预测靶点如下式所示：
[0003] 3' UUGGCU-AAAGUCUACCACGAU5' （miR-29a)
[0004] 11:1 l：llllllllll
[0005] 5， CACTGACCTTTGGATGGTGCTA3， （HIV-1 3， UTR)
[0006] Seed Match ：8~mer
[0007] Matching Score ：133
[0008] Δ G = -25. 57kcal/Mol ;
[0009] 此外，miR-29亦可下调HIV nef基因的转录，抑制nef蛋白表达，而nef蛋白是 HIV-1 病毒复制的必需成分（Mol. Cell 2009 ;34:696-709, Retrovirology 2008 ;5:117)。
[0010] 虽然miR-29能够通过促使HIV-1 mRNA降解而抑制HIV-1病毒的复制，但miRNA通 常能结合上百个基因而对其表达水平进行调节，因此miR-29作为细胞内重要的基因转录 后调控机制，可能也会对⑶4+T细胞自身产生的mRNA进行降解。目前针对miR-29a对⑶4+T 细胞自身功能的影响未见深入研究，CD4+T细胞被HIV-1感染后的凋亡机制不明确。
[0011] 由于HIV-1病毒能通过多种机制诱导⑶4+T细胞凋亡而导致免疫功能缺陷，因此 观察miR-29对⑶4+Τ细胞凋亡的调控作用，具有重要的临床意义。
【发明内容】
[0012] 本发明提供了一种抑制Bid蛋白表达的miR_29a模拟物，该miR_29a模拟物能够 通过抑制Bid蛋白表达而抑制⑶4+T细胞活化后的凋亡以及HIV病毒诱导的⑶4+T细胞凋 亡。
[0013] 一种抑制Bid蛋白表达的miR-29a模拟物，其基因序列为：5' -UAGC-ACCAUCUGAA AUCGGUUAUAACCGAUUUCAGAGGUGCUA-3'，所述基因序列的5'端带有胆固醇修饰，基因序列中 的所有核糖均带有2' -〇Me修饰。
[0014] 由于人的T细胞是悬浮细胞，用转染试剂进行基因导入有困难。目前比较常用的 方法有慢病毒载体和电穿孔法介导的基因导入，但慢病毒载体存在回复突变的可能，出于 安全性考虑较少用于人的细胞；因此现有技术中常用电穿孔法介导基因导入。
[0015] 然而T淋巴细胞不容易被外源基因转染，并且电穿孔法介导的基因导入对细胞损 伤比较严重，活化的T细胞对电穿孔法更为敏感，90%以上的T细胞均会发生凋亡，难以进 行后续实验。
[0016] 因此，本发明对miR-29a人工合成序列（如SEQ ID No. 1所示）进行5'端胆固醇 修饰和核糖的2' -OMe修饰，其中，5'端胆固醇修饰使得miR-29a模拟物无需转染试剂的 帮助即可直接进入细胞内部；而对核糖进行2' -OMe修饰则有助于增加 miR-29a模拟物的 稳定性，并且这两种修饰对miR-29a模拟物本身的功能无影响，因此能够准确有效地评估 miR-29a模拟物的功能。
[0017] 本发明首次发现，HIV感染患者⑶4+T细胞中的Bid mRNA水平较健康人⑶4+T细胞 中的Bid mRNA水平要高，并且HIV感染能显著下调CD4+T细胞内miR-29a水平；更为重要 的是，对miR-29表达水平和Bid mRNA水平进行相关性分析后发现，细胞中miR-29a水平与 促凋亡因子Bid mRNA水平呈负相关，具有统计学意义。这些发现表明Bid mRNA是miR-29a 的结合靶点，miR-29a能够抑制促凋亡因子Bid mRNA的表达（抑制率达55% )，进而抑制 ⑶4+T细胞自身的凋亡、以及HIV诱导的⑶4+T细胞的凋亡。而本发明的miR-29a模拟物验 证了上述论断。
[0018] 因此，本发明还提供了所述miR_29a模拟物在制备Bid蛋白表达抑制剂中的作用。 在包括CD4+T细胞在内的所有细胞中，只要细胞中miR-29a水平与促凋亡因子Bid mRNA水 平之间存在本发明所述的负相关性，均可采用本发明的miR-29a模拟物抑制Bid蛋白表达。
[0019] 本发明还提供了所述miR-29a模拟物在抑制⑶4+T细胞凋亡中的应用。
[0020] 本发明还提供了所述miR_29a模拟物在制备抑制⑶4+Τ细胞凋亡药物中的应用。
[0021] 由于HIV病毒不表达Bid mRNA，在本发明的相关试验中Bid mRNA均是由⑶4+Τ 细胞表达的，因此所述miR-29a模拟物能够用于抑制CD4+T细胞自身发生的凋亡，抑制率达 60%〇
[0022] 本发明还提供了所述miR_29a模拟物在抑制HIV病毒诱导的⑶4+T细胞凋亡中的 应用。
[0023] 本发明还提供了所述miR_29a模拟物在制备抑制HIV病毒诱导的⑶4+Τ细胞凋亡 的药物中的作用。
[0024] 本发明首次发现，对于感染HIV的⑶4+Τ细胞，所述miR_29a模拟物不仅能够抑制 细胞内HIV病毒的复制，而且能够抑制⑶4+T细胞中促凋亡因子Bid mRNA的表达，通过两 种抑制路径抑制HIV病毒诱导的⑶4+T细胞凋亡，抑制率达56%。
[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0026] 本发明首次发现细胞中miR-29a水平与促凋亡因子Bid mRNA水平呈负相关，表明 Bid mRNA是miR-29a的结合祀点；根据该发现设计合成了本发明的miR-29a模拟物，用于 抑制促凋亡因子Bid mRNA的表达（抑制率达55% )，进而抑制⑶4+T细胞自身的凋亡（抑 制率达60% )、以及HIV诱导的⑶4+Τ细胞的凋亡（抑制率达56% )。
【附图说明】
[0027] 图1为miR_29a模拟物、对照模拟物、miR_29a抑制物和对照抑制物基因序列和修 饰位点；
[0028] 其中，miR_29a mimic表示miR_29a模拟物，control mimic表示对照模拟物， miR_29a antagomir 表不 miR_29a 抑制物，control antagomir 表不对照抑制物，Choi 表不 胆固醇，Cy3为荧光标记，下同；
[0029] 图2a为miR_29a mimic和control mimic进入CD4+T细胞的效率；其中，CD4表不 ⑶4+T细胞，Cy3表示被焚光标记Cy3染色的⑶4+T细胞，no treatment表示未处理组（空 白组），Ctrl mimic表示control mimic (对照模拟物），下同；
[0030] 图 2b 为miR_29a antagomir 和 control antagomir 进入 CD4+T 细胞的效率；其中， Ctrl antagomir 表不 control antagomir (对照抑制物），下同；
[0031] 图3为miR_29a mimic和control mimic处理健康人⑶4+T细胞后对细胞凋亡的 影响；其中，days after activation表不活化后天数（即miR_29a mimic和 control mimic 处理后的天数）" ％ Annexin V+"表示凋亡细胞占总细胞的百分比，"林"表示p〈0. 01 (与 对照模拟物组比较），下同；
[0032] 图 4 为 miR_29a antagomir 和 control antagomir 处理健康人 CD4+T 细胞后对细 胞凋亡的影响；
[0033] 图5a为HIV早期感染病人和健康人来源的⑶4+T细胞内miR_29a表达水平；其中， HD表示健康人组，HIV表示HIV早期感染病人组，miR-29a (fold)表示miR-29a水平变化的 倍数（以健康人组为1)，"***"表示P〈〇. 001 (与健康人组比较），下同；
[0034] 图5b为HIV早期感染病人和健康人来源的⑶4+T细胞内miR-29b表达水平；其中， miR-29b (fold)表示miR-29b水平变化的倍数（以健康人组为1)，"*"表示p〈0. 05 (与健 康人组比较）；
[0035] 图5c为HIV早期感染病人和健康人来源的⑶4+T细胞内miR-29c表达水平；其中， miR-29c(fold)表示miR-29c水平变化的倍数（以健康人组为1);
[0036] 图6为健康人的CD4+T细胞感染HIV-1 pNL4-3后培养上清中p24蛋白水平；其中， Days after infection表示感染后天数，下同；
[0037] 图 7a 为 HIV-1 pNL4_3 感染的健康人 CD4+T 细胞经 miR_29a mimic 和 control mimic处理后细胞凋亡的变化；其中，Annexin V表示能与Annexin V结合的细胞（即凋亡 细胞），7-AAD表示被7-AAD染色的细胞（即坏死细胞），Sample 1、Sample 2、Sample 3分 别表不样品1、样品2、样品3 ;
[0038] 图7b为图7a中Annexin V阳性细胞所占比例的统计结果；其中，"林"表示 Ρ〈0· 01 (与 Crtl mimic 组相比）；
[0039] 图8为miR-29a mimic对HIV-1 pNL4-3感染后的CD4+T细胞培养上清中p24蛋 白水平的影响；其中，表示P〈〇. 05 (与对照模拟物组比较）；
[0040] 图9为健康人⑶4+T细胞经miR-29a mimic处理后可能靶基因 mRNA水平的变化； 其中，Relative mRNA level表不mRNA相对表达水平；
[0041] 图10a为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子Bid mRNA的表 达水平；其中，bid(fold)表示Bid mRNA水平变化的倍数（以健康人组为1)，"**"表示 Ρ〈〇·〇1(与健康人组相比）；
[0042] 图10b为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+Τ细胞中促凋亡分子Bim mRNA的表 达水平；其中，bim(fold)表示Bim mRNA水平变化的倍数（以健康人组为1);
[0043] 图10c为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子puma mRNA的表 达水平；其中，puma (fold)表示puma mRNA水平变化的倍数（以健康人组为1);
[0044] 图10d为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子Bmf mRNA的表 达水平；其中，Bmf (fold)表示Bmf mRNA水平变化的倍数（以健康人组为1);
[0045] 图10e为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子BaklmRNA的表 达水平；其中，Bakl (fold)表示Bakl mRNA水平变化的倍数（以健康人组为1);
[0046] 图10f为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子Bax mRNA的表 达水平；其中，Bax (fold)表示Bax mRNA水平变化的倍数（以健康人组为1);
[0047] 图11a为HIV感染病人的⑶4+T细胞中miR-29a表达水平与Bid mRNA水平的 相关性；其中，delta Ct(miR-29a-U6)表示miR-29a Ct值与U6 Ct值的相差数内，delta Ct (Bid-GAPDH)表示Bid Ct值与GAPDH Ct值的相差数，下同；
[0048] 图lib为HIV感染病人的⑶4+T细胞中miR-29b表达水平与Bid mRNA水平的相 关性；其中，delta Ct(miR-29b-U6)表示miR-29b Ct值与U6 Ct值的相差数；
[0049] 图11c为HIV感染病人的⑶4+T细胞中miR-29c表达水平与Bid mRNA水平的相 关性；其中，delta Ct(miR-29c-U6)表示miR-29c Ct值与U6 Ct值的相差数；
[0050] 图12为miR-29a结合Bid mRNA的预测靶点；
[0051] 图13为HIV-1 pNL4-3感染的健康人CD4+T细胞经miR-29a mimic处理后Bid蛋 白水平的变化；其中，HIV-1 inf