结核分枝杆菌KatG突变基因及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种结核分枝杆菌KatG突变基因，以及用于检测导致结核分枝杆菌 异烟肼耐药基因 KatG突变c. 906OA的试剂盒，属于结核病耐药基因突变检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 结核分枝杆菌引发常见的慢性呼吸道传播疾病一结核病，主要累及脏器为肺， 此外还会侵犯皮肤、骨骼等全身多个组织和器官，多集中在15-35岁的青壮年发病。核病全 球流行，但发展中国家患病人数相对较多，随着结核药物的应用和生活及医疗水平的提高， 结核病的发病率有所降低。近年，抗生素滥用、环境污染和艾滋病等原因导致的结核发病率 和耐药率均有所增加。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO) 2008年报 道，全球结核病的总耐药率高达20%，耐多药率约为5. 3%，而我国调查数据显示中国肺结核 耐多药率为8. 3%，可见我国耐药结核患者的预防和治疗工作刻不容缓。
[0003] 自1952年发现异烟肼具有全效能杀结核分枝杆菌复合物以来，无论单独或联合 应用该药对患者进行治疗，异烟肼（INH)都是抗结核一线药物。目前研究表明KatG基因突 变是常见的导致异烟肼耐药的原因之一。KatG基因编码结核菌过氧化氢-过氧化物酶，该 酶可激活 INH 为 INH 自由基，INH 自由基与辅酶 I (Nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+)形成共价化合物，抑制烯酰基乙酰载体蛋白还原酶(该酶由InhA基因编码)的功能，进 而阻止细胞壁分枝菌酸的合成，导致病原菌死亡。若KatG基因发生突变，则会阻止INH转 化为活性物质从而失去作用，导致结核菌产生抗药性。目前报道的KatG基因的常见突变为 315位(丝氨酸突变为苏氨酸）和463位(精氨酸突变为亮氨酸）的氨基酸改变，不同国家报 道的数据表明，超过60%的KatG基因突变发生在氨基酸315位点。同时发现KatG基因存 在热点突变区域，在315位氨基酸附近，还存在多个氨基酸位点的突变。我国对结核杆菌耐 异烟肼的KatG基因的研究也较多，但是多数研究仅针对315和463两个常见突变位点进行 检测，这可能导致一些其他突变热点区的突变位点在检测时被忽视，从而影响临床诊断。
[0004] 由于全球获得性免疫缺陷（AIDS)患者数量的增多，结核作为机会性致病菌，其发 病率也有逐年增多的趋势。因此对结核患者早期进行诊断，并且对耐药结核患者的具体耐 药机制进行确诊，提前调整对该类患者的临床用药，将大大缩短临床诊断时间，有助于早期 发现其耐药机制，特别是对一些耐多药患者进行突变热点的基因诊断，从而采取有效的临 床治疗措施，将大大提高该类患者的治愈率。异烟肼是临床常用抗结核药物之一，也是一线 常规用药，因此对结核杆菌耐异烟肼KatG基因的突变热点区进行基因检测，将有利于临床 快速诊断和治疗。
[0005] 经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌KatG突变基因的方法，该结核分 枝杆菌KatG突变基因具有c. 906OA突变位点，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0007] 本发明另一目的是提供用于检测结核分枝杆菌KatG突变基因的试剂盒，该试剂 盒包括用于检测结核分枝杆菌KatG基因 c. 906OA突变的试剂。
[0008] 所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示的引物。
[0009] 本发明通过检测来自耐异烟肼结核菌株的样本中是否存在KatG基因的c. 906OA 突变，从而判断该患者耐异烟肼药物的耐药分子机制；其中c. 906OA突变位点为KatG基因 的突变，该突变导致KatG基因第302位的丝氨酸（Ser)突变为精氨酸（Arg)，这个氨基酸的 改变，影响了药物异烟肼转化为活性物质成分，发挥其抗结核分枝杆菌的作用，从而使该菌 株产生耐药。
[0010] 发明人用候选基因筛查的方法，在中国33株耐异烟肼结核菌株中进行检测，在一 株耐药结核菌种发现与耐异烟肼相关的KatG基因新突变c. 906OA ;该突变的频率为3%，这 说明在耐异烟肼的结核菌株中，KatG基因突变c. 906OA具有一定的发生频率，因此Kat基 因突变c. 906OA可以作为临床异烟肼耐药菌株耐药分子机制的诊断依据，并且目前，在国 际和国内均未见该突变的报道。
[0011] 本发明用于检测KatG基因突变c. 906OA的试剂盒，包括用于检测KatG基因的突 变c. 906OA所需的常规试剂和能选用的用于扩增KatG基因的试剂和PCR引物。
[0012] 用于检测KatG基因突变c. 906OA的试剂盒，包括以下一种或几种试剂的组合： (1) 从待检样品中提取DNA的试剂； (2) 用于扩增结核菌样本DNA的KatG基因 c. 906OA突变的PCR引物和相关的PCR反 应试剂； (3) PCR产物纯化试剂； (4) 对PCR产物进行直接测序的试剂。
[0013] 用于检测KatG基因突变c. 906OA的试剂盒，所用的PCR引物为： KatG-F :5' -CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3' KatG-R:5' -GGGGCTGATCTACGTGAAC-3' ； 用于检测KatG基因突变c. 906OA的试剂盒，所述检测PCR扩增产物的试剂选自测序 检测试剂、限制性内切酶长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试 剂及SNP分型检测试剂。
[0014] 采用PCR扩增-直接测序的方法来检测样本的突变情况，具体操作步骤如下： (1) 采集待测个体的样本，为培养的结核菌样本，提取全基因组DNA ; (2) 以提取的DNA为模板，以本发明设计的针对KatG基因 c. 906OA突变的引物进行突 变区段DNA序列的扩增，得到相应的PCR扩增产物； (3) 将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，将所测得的序列与KatG基因的正常 序列进行比对，确定c. 906OA突变是否存在； (4) 根据以上实验结果分析患者是否为KatG基因突变c. 906OA导致的耐异烟肼结核 分枝杆菌菌株； (5) 按照正常编码序列阅读框对突变序列进行翻译，进一步确定p. S302R突变的存在。
[0015] 发明人在收集耐药结核分枝杆菌进行实验的过程中，收集到33株耐异烟肼的结 核菌株，在取得患者同意的前提下，对患者感染的结核分枝杆菌进行基因检测。同时，我们 还收集了患者的基本信息和临床信息，详细询问了其感染和发病过程，建立了结核分枝杆 菌耐药株的样本库。将灭活的结核分枝杆菌冻存于-80°C冰箱。用柱吸附的方法提取结核 菌的基因组DNA，保存于-40°C冰箱，每份DNA样本具有对应的患者资料和耐药信息。用引 物设计软件Primer5和01igo6设计PCR扩增引物，包括了结核菌KatG基因549位到1531 位碱基的DNA片段，用于PCR扩增。PCR扩增产物直接用PCR引物进行正反向测序(测序 所用仪器为ABI公司3730型DNA测序仪)。将得到的序列与GenBank中的序列（序列号： KC692358. 1)进行比对，确定KatG基因突变c. 906OA的存在，按照开放阅读框进行翻译，确 定氨基酸突变P. S302R的存在。
[0016] KatG基因 c. 906OA突变的核苷酸和氨基酸序列如下：
[0017] KatG基因 c. 906OA突变的核苷酸和氨基酸序列中，用方框标出的是突变的碱基 和氨基酸，突变前第302位氨基酸是丝氨酸，突变后为精氨酸。该突变位于KatG基因编码 序列的第906位碱基，由野生型的胞嘧啶（C)变为腺嘌呤（A)，该突变使野生型的KatG蛋白 的第302位丝氨酸突变成精氨酸，导致KatG蛋白的功能发生改变，进而引起异烟肼的耐药。 KatG基因突变c. 906OA的检测能够用遗传领域的任意一种点突变检测方法进行，如PCR (聚合酶链反应）-RFLP法(限制性内切酶片段多态性)、PCR-测序法、DNA