用于苦柯胺b质量控制中的参比化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种苦柯胺B检测方法及用于检测苦柯胺B 中的参比化合物。
【背景技术】
[0002] 苦柯胺B(KukoamineB，化学结构如式1所示）：
[0003]
[0004] 天然产物苦柯胺B(KukoamineB)是ShinjiFunayama等首次从地骨皮中分离提 取的生物碱类化合物。苦柯胺B能有效拮抗导致脓毒症的细菌病原体相关分子一内毒素/ 脂多糖（endotoxin/lipopolysaccharide，LPS)和细菌DNA(CpGDNA)，对治疗胺毒症表现 出良好活性，且作用明显优于阳性对照药物，因而具有良好的成药前景。
[0005] 苦柯胺B的在制备和放置过程中容易因为酸、碱、氧化等条件的改变而使得其有 关物质增高。目前没有对苦柯胺B杂质的研究，也没有关于苦柯胺B杂质来源的详细研究 报道。为了更好的研究苦柯胺B的药物性质，提高苦柯胺B的药物质量。实验人员对苦柯 胺B的有关物质进行了分离、富集、分别收集，然后进行了结构确证。为了能够获得更大量 的杂质样品，实验人员对其结构进行了分析，然后对其合成路线进行了研究。
[0006] 实验过程中我们发现，苦柯胺B较不稳定，在无保护的碱性水溶液情况下，极容易 产生大量的杂质。如在较强碱性条件或酰胺水解酶的作用下极容易造成酰胺键断裂，从而 造成多个活性基团的结合。
[0007] 为此，我们对苦柯胺B在生产过程中所产生的杂质进行研究，并根据杂质的特点， 设计一种苦柯胺B的含量检测方法。
[0008] 中国专利CN201010539028. 4公开苦柯胺B的合成路线如下：
[0009]
【发明内容】
[0010] 本发明的目的之一在于，提供一种用于检测苦柯胺B含量的参比化合物1，其结构 如下：
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[0012] 本发明还提供参比化合物1的制备方法，合成路线如下：
[0013]
[0014] 具体的，本发明所述参比化合物1的制备方法，包括以下步骤：
[0015] 24.lg化合物0(0.lmol)、31.4ml的三乙胺（0. 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷 中，将3, 4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结 束后，冰浴反应约lh，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全，浓缩有机溶剂，加入稀盐 酸500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品， 柱层析，得纯品化合物B1。
[0016] 46. 8g化合物B1 (0· 08mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml 和RaneyNi4. 3g，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压爸中50°C条件下搅拌反应 12 ±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全，抽滤，浓缩得粗品，柱层析，得纯品化 合物B2,黄色油状物。
[0017] 41. 2g化合物B2(0. 7mol)、3L4ml的三乙胺（0· 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲 烷中，将3, 4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加 结束后，冰浴反应约lh，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩有机溶剂，加入 稀盐酸500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗 品，柱层析，得纯品化合物B3。
[0018] 93. 3g化合物B3 (0·lmol)溶于600ml二氯甲烷中，室温搅拌下缓慢加入300ml饱 和的盐酸乙醚溶液，冰浴下反应6±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全，浓缩， 抽滤，得产物化合物B4。
[0019] 66. 6g化合物Μ(0· 08mol)溶于400ml甲醇中，室温搅拌下滴入丙烯腈 (13.6ml，0. 20mol)的甲醇（100ml)溶液，滴加结束后，室温反应5±2h，通过薄层层析监控 反应终点，直至反应完全。浓缩得化合物B5。
[0020] 62g化合物B5(0. 7mol)、77ml的三乙胺（0. 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中， 将3, 4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束 后，冰浴反应约lh，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩有机溶剂，加入稀盐酸 500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱 层析，得纯品化合物B6。
[0021] 61. 5g化合物B6(0. 05mol)溶于60ml四氢咲喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml 和RaneyNi4. 3g，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压爸中50°C条件下搅拌反应 12±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。抽滤（硅藻土助滤），浓缩得粗品，柱 层析，得纯品化合物B7，黄色油状物。
[0022] 49g化合物B7((X04mol)、7ml的三乙胺（0· 044mol)溶于200ml干燥的二氯甲烷 中，将3, 4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结 束后，冰浴反应约lh，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩有机溶剂，加入稀盐 酸200ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。 柱层析，得纯品化合物B8。
[0023] 47g化合物B8(0.03mol)溶于30ml四氢呋喃中，加入700ml甲醇，4.8g10%钯/ 碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应15±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。 过滤，真空干燥得化合物1。
[0024] 本发明的目的之一在于，提供一种用于检测苦柯胺B含量的参比化合物2,其结构 如下：
[0025]
[0026] 本发明还提供参比化合物2的制备方法，合成路线如下：
[0028] 具体的，本发明所述参比化合物2的制备方法，包括以下步骤：
[0029] 12g化合物B7(0.01mol)溶于10ml四氢呋喃中，加入100ml甲醇，1.2g10%钯/ 碳后，排尽空气，氢气常压下室温反应15±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。 过滤，真空干燥得化合物2。
[0030] 本发明的目的之一在于，提供一种用于检测苦柯胺B含量的参比化合物3,其结构 如下：
[0031]
[0032] 本发明还提供参比化合物3的制备方法，合成路线如下：
[0033]
[0034] 具体的，本发明所述参比化合物3的制备方法，包括以下步骤：
[0035] 38g化合物C2 (0.lmol)、15. 7ml的三乙胺（0.llmol)溶于200ml干燥的二氯甲烷 中，将0.ImoICBZCl用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束后，冰浴 反应约lh，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩有机溶剂，乙酸乙酯400ml萃 取，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物C3。
[0036] 51. 3g化合物C3 (0.lmol)溶于100ml二氯甲烷中，室温搅拌下缓慢加入300ml饱 和的盐酸乙醚溶液，冰浴下反应6±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩， 抽滤，得产物化合物C4。
[0037] 33g化合物C4(0. 08mol)溶于100ml甲醇中，室温搅拌下滴入丙烯腈 (13.6ml，0. 20mol)的甲醇（100ml)溶液，滴加结束后，室温反应5±2h，通过薄层层析监控 反应终点，直至反应完全。浓缩得化合物C5。
[0038] 28g化合物C5(0. 06mol)、3L4ml的三乙胺（0· 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲 烷中，将0. 06m〇13, 4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴 入，滴加结束后，冰浴反应约lh，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩有机溶 剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤， 浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物C6。
[0039] 48g化合物C6(0. 06mol)溶于40ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml 和RaneyNilOg，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压爸中50°C条件下搅拌反应 12±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。抽滤，浓缩得粗品。柱层析，得纯品化 合物C7,黄色油状物。
[0040] 8.lg化合物C7(0.01mol)溶于10ml四氢呋喃中，加入100ml甲醇，lg10%钯/碳 后，排尽空气，氢气常压下室温反应15 ± 2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。过 滤，真空干燥得化合物3。
[0041] 本发明的目的之一在于，提供一种用于检测苦柯胺B含量的参比化合物4,其结构 如下：
[0042]
[0043] 本发明还提供参比化合物4的制备方法，合成路线如下：
[0044]
[0045] 具体的，本发明所述参比化合物4的制备方法，包括以下步骤：
[0046] 35. 4g化合物B2(0. 06mol)、3L4ml的三乙胺（0· 22mol)溶于 400ml干燥的二氯 甲烷中，将0. 06molCBZCl用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴入，滴加结束 后，冰浴反应约lh，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩有机溶剂，乙酸乙酯 400ml萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物D1。
[0047] 72. 4g化合物C3 (0.lmol)溶于100ml二氯甲烷中，室温搅拌下缓慢加入300ml饱 和的盐酸乙醚溶液，冰浴下反应6±2h，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩， 抽滤，得产物化合物D2。
[0048] 50g化合物D2 (0. 08mol)溶于100ml甲醇中，室温搅拌下滴入丙烯腈 (13.6ml，0. 20mol)的甲醇（100ml)溶液，滴加结束后，室温反应5±2h，通过薄层层析监控 反应终点（硅胶板：GF254，展开剂：二氯甲烷：甲醇=10:1)，直至反应完全。浓缩得化合物 D3〇
[0049] 41g化合物D3 (0. 06mol)、31. 4ml的三乙胺（0. 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲 烷中，将0. 06m〇13, 4-二苄氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴搅拌下缓慢滴 入，滴加结束后，冰浴反应约lh，通过薄层层析监控反应终点，直至反应完全。浓缩有机溶 剂，加入稀盐酸500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤， 浓缩得粗品。柱层析，得纯品化合物D4。
[0050] 61g化合物D4(0. 06mol)溶于40ml四氢呋喃中，加入饱和的氨甲醇溶液800ml 和RaneyNilOg，排尽空气后，约3MPa的氢气压力下，于高压爸中50°C条件下搅拌反应 12±2h，通过薄层层析