一种尿促性素的提纯方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物提纯领域，特别是一种尿促性素的提纯方法。
【背景技术】
[0002] 绝经期促性腺激素（简称尿促性素，HMG)含有促卵泡激素（FSH)和促黄体生产素 (LH)两种活性成分，他们是由垂体前叶嗜碱性细胞合成的糖蛋白激素，由α、β两个亚基 组成，临床上主要用于治疗不育症，由垂体或绝经期妇女尿提取得到，也可以通过DNA重组 技术制备。
[0003] 临床上应用的主要是高比活的尿促性素，而从绝经期妇女尿中直接提取的尿促性 素为粗品，需要进过多个步骤的纯化才能达到要求，高比活的尿促性素主要通过色谱分离 技术来实现，由于从绝经期妇女尿中提取的尿促性素粗品含有大量的杂蛋白及其他有机物 质，会降低色谱柱柱效，降低色谱分离纯化能力，达不到预期效果，而不能够直接进行色谱 分离提纯促卵泡激素。
[0004] 因此，在进行尿促卵泡素色谱纯化之前，需要进行中间体生产，即抽提。目前为 止，关于尿促性素提纯通常都是用70 %乙醇-10 %乙酸铵进行抽提，然后再进行后续色谱 分离纯化，如《乙酸铵提纯尿促性素的方法》（【申请号】201210598002. 6)中所公开：采用 5 % -20 %乙酸铵~70 %乙醇提纯体系10°C下搅拌提取2h过滤，滤渣用5 % -20 %乙酸铵~ 70%乙醇继续提取1次，两次上清液加入95%乙醇10°C下搅拌静置过夜；过滤、洗涤、干燥 得产品。实际操作中，该抽提方法所得产品活性回收率在70%~80%之间，并且最大的缺 陷在于总活性损失大，产品的免疫及生物效价低，不能够有效保护产品的生物学活性。
【发明内容】
[0005] 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种生物效价高，活性回收 率高，操作简单的尿促性素提纯方法。
[0006] 本发明解决其技术问题的技术方案是：一种尿促性素的提纯方法，其特征在于，步 骤包括：
[0007] (1)抽提液配制：取乙酸铵、甲醇、纯化水，搅拌得抽提液A;取乙酸钠、甲醇、纯化 水，搅拌得抽提液B;
[0008] (2) -次溶解抽提：按每公斤尿促性素粗品加入抽提液A50~80L、吸附剂0· 5~ 2Kg，搅拌150~210min后，过滤，收集滤液；
[0009] (3)甲醇沉淀：步骤⑵所得滤液，加入醋酸并搅拌，然后加入混合液1~1. 5倍 体积的甲醇，继续搅拌20~30min，静置14~18h后，过滤，吹干滤饼、粉碎，烘干，得尿促性 素初品；
[0010] (4)二次溶解抽提：步骤（3)所得的尿促性素初品，按每公斤尿促性素初品加入 80~100L抽提液B、吸附剂0. 5~2Kg，搅拌150~210min，过滤，收集滤液；
[0011] (5)二次甲醇沉淀：步骤（4)所得的滤液中加入0.78~0.82倍体积的甲醇，搅拌 20~30min，静置14~18h，过滤；
[0012] (6)产品收集：步骤（5)所得的滤饼吹干后收集沉淀物，粉碎，烘干，得提纯尿促性 素。
[0013] 上述的抽提液A中乙酸铵的质量百分浓度为4~10%、甲醇体积百分浓度为40~ 70% ;所述的抽提液B中乙酸钠的质量百分浓度为1%、甲醇体积百分浓度为40%。
[0014] 上述的吸附剂为娃藻土、膨润土，或活性炭。
[0015] 上述步骤（2)、（3)、（4)、（5)中的过滤为板框式压滤机过滤。
[0016] 与现有技术相比较，本发明具有以下突出的有益效果：
[0017] 1、取用全新的抽提液体系，抽提体系中采用"甲醇-乙酸铵/甲醇-乙酸钠"复合 抽提体系，其目的在于保证产品回收率的同时，适度增加整个溶液体系的极性，使之更利于 FSH空间结构的稳定，有效降低尿促性素粗品中极性差的杂质成分在抽提系中溶解度，而尿 促性素在该抽提体系中能够完全溶解，这样保证杂质有效去除的同时保证了产品回收率；
[0018] 2、"甲醇-乙酸铵/甲醇-乙酸钠"复合抽提体系中的比例对于抽提效果也具有决 定性意义：通过适当降低抽提体系乙酸铵浓度，溶液体系的离子强度降低，蛋白等杂质成份 溶解度降低，而尿促性素在此乙酸铵浓度下能够完全溶解，保证了产品回收率；本发明方案 中甲醇-乙酸铵的比例关系确保了产品回收率和纯度的良好平衡；
[0019] 3、本发明方案通过两次抽提：即7%乙酸铵~60%甲醇一次抽提，将产品单位效 价提高10以上后，采取1 %乙酸钠~40%甲醇二次抽提，复合抽提体系两次抽提的目的在 于将抽提溶液环境变得更温和，更利于FSH空间结构的稳定，蛋白质分子处在强酸、强碱、 高盐等条件下，空间结构极易发生变化，从而导致蛋白质生物活性降低甚至丧失，在蛋白质 提纯时，在保证回收率的同时，需尽可能提供一个温和的反应条件。在保证产品回收率的同 时，将一次抽提所得产品单位效价提高1. 5~2倍，通过两次抽提将FSH单位效价提高13~ 16倍，利用两次抽提所得产品进行后续色谱纯化，在保证产品回收率的前提下，有效提高色 谱柱的柱效，延长色谱柱的使用寿命，提高生产效率，降低成本；
[0020] 4、使用本发明方法制得的FSH生物效价在15IU/mg以上，活性回收率在95%以上， 对原料生物活性无破坏。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合【具体实施方式】对本发明进一步说明。
[0022] 对比例：
[0023] (1)抽提液配制：称取100g乙酸铵溶解于1000ml70 %的乙醇溶液中即得10%乙 酸铵~70 %乙醇溶液；
[0024] (2)称取20g尿促性素粗品溶于步骤（1)制得的溶液中，常温搅拌8h，离心取上清 液；
[0025] (3)向步骤⑵得到的上清液内加入2. 5L95%乙醇，搅拌lh，静置过夜，离心，收 集沉淀物，用适量丙酮脱水后于真空干燥箱干燥得尿促性素提纯物。
[0026] 实施例1
[0027] (1)抽提液配制：取乙酸铵7kg、甲醇60L，加入纯化水定容为100L，搅拌lOmin，得 7%乙酸铵~60%甲醇的抽提液A;取乙酸钠lkg、甲醇40L，加入纯化水定容为100L，搅拌 lOmin，得1%乙酸钠~40%甲醇的抽提液B;其中所述的乙酸铵、乙酸钠为质量百分浓度， 甲醇为体积百分浓度；
[0028] (2) -次溶解抽提：称取lKg尿促性素粗品，以及抽提液A50L，投入加工罐内，同 时加入0. 5Kg娃藻土，搅拌210min后，板框式压滤机过滤，收集滤液；由于甲醇比乙醇极性 强，与水的极性更加接近能够完全互溶，在保证产品回收率的同时，整个溶液体系的极性更 强，更利于FSH空间结构的稳定，降低乙酸铵的浓度使抽提液离子强度降低，尿促卵泡素粗 品中极性差的杂质成分在该抽提液中溶解度降低，而尿促卵泡素在60%甲醇~7%乙酸 铵溶液中能够完全溶解，这样既保证了产品回收率，又能有效去除杂质；
[0029] (3)甲醇沉淀：步骤（2)所得滤液测定pH，按照体积比醋酸：滤液=1 :200,加入 浓度为99 %的醋酸并搅拌，然后加入混合液1. 5倍体积99 %的甲醇，继续搅拌30min，静置 18h后，板框式压滤机过滤，压缩空气吹干滤饼、粉碎过30目筛，真空烘干，得尿促性素初 品；
[0030] (4)二次溶解抽提：步骤⑶所得的尿促性素初品，按每公斤尿促性素初品加入 90L抽提液B，及0. 5Kg娃藻土与加工罐内，搅拌150min，板框压滤机过滤，收集滤液；二次 抽提采用的是"甲醇-乙酸钠"体系，并且该体系的浓度较一次抽提有明显降低，其原因在 于经由一次抽提的尿促性素初品更容易造成生物活性降低，因此在保留甲醇极性增强的基 础上，通过乙酸钠将一次抽提中依旧存在的杂质进行促沉淀，并且不影响尿促卵泡素在该 体系中的溶解度；
[0031] (5)二次甲醇沉淀：步骤（4)所得的滤液中加入0.82倍体积的99%甲醇，搅拌 30min，静置18h，板框压滤机过滤；
[0032] (6)产品收集：步骤（5)所得的滤饼压缩空气吹干后收集板框内沉淀物，粉碎过30 目筛，收集板框内沉淀物于22°C、真空度-100~_90kPa真空箱内烘干8h，得提纯尿促性 素。
[0033] 本发明抽提体系中采用"甲醇-乙酸铵/甲醇-乙酸钠"复合抽提体系，其目的在 于保证产品回收率的同时，适度增加整个溶液体系的极性，使之更利于FSH空间结构的稳 定，有效降低尿促性素粗品中极性差的杂质成分在抽提系中溶解度，而尿促性素在该抽提 体系中能够完全溶解，这样保证杂质有效去除的同时保证了产品回收率。"甲醇-乙酸铵/ 甲醇-乙酸钠"复合抽提体系两次梯度抽提：目的在于将抽提溶液环境变得更温和，更利 于FSH空间结构的稳定，蛋白质分子处在强酸、强碱、高盐等条件下，空间结构极易发生变 化，从而导致蛋白质生物活性降低甚至丧失，在蛋白质提纯时，在保证回收率的同时，需尽 可能提供一个温和的反应条件。
[0034] 通过浓度配比和极性干扰，达成增加产品回收率，且不会影响纯度，并且能最大程 度的保护产品的生物学活性。