抗pmi蛋白的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及识别非抗生素类安全筛选标记PMI(磷酸甘露糖异构酶）的单克隆抗 体，该抗体可用于制备检测转基因植物中的PMI蛋白的试剂盒，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002] 随着转基因产品的不断涌现，随之而来的问题就是转基因产品的安全评价及测 定。在转基因品种的培养和后期鉴定中，离不开针对转化的筛选标记和报告基因，最常用 的筛选标记包括抗生素抗性类筛选标记基因和抗除草剂基因，这类抗性筛选标记基因有可 能会通过基因漂移造成基因污染，对环境产生不利影响（魏伟，马克平.如何面对基因流 和基因污染[J].中国农业科技导报，2002,4(4):10-15)。另外，含有该种标记基因的转 基因食物有可能不会被人类的肠道系统吸收利用，还很有可能产生毒副作用。所以，为降 低生物安全风险，减少对环境和生物的潜在危害，目前对转基因植物的筛选已经逐渐由利 用抗生素抗性筛选，过渡到以PMI为代表的非抗生素抗性筛选，最终实现更安全的无标签 (Marker-free)筛选鉴定体系。
[0003] 在糖类代谢中，PMI基因编码的磷酸甘露糖异构酶（phosphomannoseisomerase， PMI)催化甘露糖-6-磷酸转变为果糖-6-磷酸，然后在磷酸果糖激酶的催化作用下生成 能进入糖酵解途径的果糖 -1，6_ 二磷酸（MilesJS，GuestJR.Nucleotidesequence andtranscriptionalstartpointofthephosphomannoseisomerasegene(manA)of Escherichiacoli[J]·Gene, 1984,32:41-48)。研究发现几乎所有植物细胞除了肉桂和一 些豆类，都没有PMI基因，但在细菌、酵母、动物以及人体中却广泛存在（MalcaI，EndoRM， LongMR.Mechanismofglucosecounteractionofinhibitionofrootelongation bygalactose,mannoseandglucosamine[J] ·Phytopathology, 1967, 57:272-278),目前 已从这些生物体中克隆到该基因，并获得纯化蛋白（ProudfootAEI，TurcattiG，Wells TNC,etal. .Purification,cDNAcloningandheterologousexpressionofhuman phosphomannoseisomerase[J] ·Eur.J.Biochem. ,1994,219:415-423.)〇
[0004] 自1998年首次报道了将PMI基因作为筛选标记用于甜菜的转基因以来（Joersbo M,DonaldsonI,KreibergJ,etal.Analysisofmannoseselectionusedfor transformationofsugarbeet[J].Mol.Breed·,1998,4:111_117)，PMI/甘露糖筛选体系 作为一种新型的安全筛选系统已被成功运用于多种单子叶植物和双子叶植物的遗传转化 中无论是筛选标签选择、更替的过程，还是在后代选择中通过同源重组将筛选标签从生物 体基因组"删除"的过程中都需要对标签蛋白进行跟踪鉴定。此外，对这些标签蛋白进行检 测还可以监测品种培育过程中对环境的影响，结合特异功能靶蛋白的鉴定，可以开展农业 生产中的种子纯度鉴定，食品、药品加工过程的非转基因身份保持（IP)，从而实现对转基因 植物从源头到餐桌的全程监控。
[0005] 基于外源蛋白的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，可实现对转 基因植物样本快速、准确、高效的检测。其技术关键是制备具有高度特异性的抗体，直至目 前为止还没有关于PMI抗体的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种针对转基因植物中常用筛选标记基因PMI蛋白 的单克隆抗体杂交瘤的制备方法。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种特异性好、亲和力高的抗PMI单克隆抗体，该抗 体能特异结合PMI重组抗原和转基因材料。
[0008] 本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于以水稻为代表的转基因生物的检 测方法。
[0009] 本发明的第四个目的是提供一种利用本抗体与PMI的结合能力，完成表达PMI蛋 白在转基因植物、转基因动物、转基因微生物、细胞或其他材料中的分选和富集方法。
[0010] 解决技术问题所采用的技术手段
[0011] 本发明首先制备了两株分泌抗PMI抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制 备方法包括以下步骤：
[0012] 1)按照公布的PMI编码序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨 基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表 达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便于纯化，在重组蛋白的N端和C端分 别融合有大肠杆菌果胶酶的PelB信号肽及组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载 体pET-pelB中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原， 免疫Balb/c小鼠。
[0013] 2)从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞 与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融 合细胞生长克隆；
[0014] 3)以重组PMI蛋白为抗原，应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技术 筛选和鉴定后，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。
[0015] 上述技术方案中，步骤1)中，制备重组⑶S蛋白的方法可以按照本领域技术人员 熟知的DNA和蛋白质表达操作技术进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表 达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养，重组蛋白的纯化。具 体地，可参考《分子克隆实验指南（第三版）》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译， 2009年，科学出版社）。
[0016] 本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的两株杂交瘤细胞株及其抗体 60728-35和60728-44。其中60728-35的抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQID No:2 和SEQIDNo:3 所示，60728-44 为SEQIDNo:4 和SEQIDNo:5 所示。两株抗体均 为鼠源IgGl亚型单克隆抗体。
[0017] 本发明从上述杂交瘤细胞株制备了单克隆抗体，所述制备方法有以下两种：
[0018] 1)在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离 纯化所需单克隆抗体；
[0019] 2)在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗 体。本发明用腹水法制备的抗体经ProteinA/G柱亲和层析纯化得到的PMI单抗，用ELISA 技术测定60728-35和60728-44分泌的抗体亲和常数分别为1. 85X109和2. 46XΙΟ9。
[0020] 本发明的这两株抗体可以共同或单一地对生物样品中的ΡΜΙ蛋白进行免疫学检 测。可以应用的免疫学检测方法包括但不限于利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸附 检测（ELISA)、免疫印迹（WesternBlot)、流式细胞术（FACS)、免疫组织化学（IHC)检测 或者免疫PCR检测方法。在免疫学检测中，该抗体可单独或与通过化学键偶联，静电吸 附或者亲疏水性吸附，而连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP)，碱性磷酸酶（AP)，生物 素（Biotin)，异硫氰酸荧光素（FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖等缀合物连接。免疫印记 (Westernblotting)实验显示这两株抗体均能特异识别重组的PMI蛋白以及天然水稻叶 片材料中的转基因筛选标记基因PMI。
[0021] 本发明中的单克隆抗体，可以用作检测试剂用于转基因植物检测试剂盒的制备。 本发明的这两株抗体还可以共同或单一地对含PMI蛋白的生物样品进行基于免疫学的生 物分离中。该基于免疫学的分离方法包括但不限于利用琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流式 细胞术完成生物分离方法或阳性细胞分选。
[0022] 本发明的优点及有益效果
[0023] 本发明获得的杂交瘤（60728-35和60728-44)分泌产生的单克隆抗体，能识别重 组和天然PMI蛋白，具有极强特异性和敏感性。能用于转基因植物的检测与筛查。
【附图说明】：
[0024] 图1 :在大肠杆菌中表达和纯化的PMI重组蛋白。1为表达产物15mM咪唑洗脱的 结果，2为60mM咪唑洗脱的结果，3为300mM咪唑洗脱的结果。Marker为分子量蛋白，表达 产物的大小约为43kDa，使用12%SDS-PAGE凝胶。
[0025] 图2 :单克隆抗体60728-35对重组蛋白和天然转基因水稻叶片蛋白的免疫印迹检 测结果，TP309为非转基因材料，M2-B4和M3-3为转基因水稻叶片蛋白，菌蛋白为重组PMI 蛋白。
[0026] 图3 :单克隆抗体60728-44对重组蛋白和天然转基因水稻叶片蛋白的免疫印迹检 测结果，TP309为非转基因材料，M2-B4和M3-3为转基因水稻叶片蛋白，菌蛋白为重组PMI 蛋白。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可 以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
[0028] 实施例1重组PMI蛋白的制备
[0029] 一、基因克隆
[0030] PMI单克隆Genbank中NC_004088. 1的核酸序列，设计特异性上游引物PMI-F: TATGTACATATGCAAAAACTCATTAACTC特异性下游引物PMI-R:AGTGCTCGAGCTTGTTGTAAACACGC， 从淋巴细胞中的反转录产物中扩增包括编码第411位至第750氨基酸的基因片段。在PCR 的过程中在基因5'和3'端分别加入Ndel和Xhol酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳 分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体pET_30a进行Ndel和Xhol 酶切，再次电泳回收，以T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取 平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行 测序分析，序列完全正确的克隆用于蛋白表达。
[0031] 二、蛋白表达和纯化
[0032] 按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mlLB培养基，加入终浓度为 50μg/ml的卡那霉素，37°C振荡培养至0D6。。为(λ6~(λ8。加入(λlmol/L的IPTG，25°C 震荡培养8h