稀有细胞富集装置和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞分离、检测领域，尤其涉及一种从细胞悬液中高回收率筛选收集稀有细胞的装置和方法。
【背景技术】
[0002]为了医学诊疗等目的，会需要从人或动物的血液、组织液或淋巴液，尤其是血液中筛选、分离出游离其中的特定目标细胞，主要是病变的细胞或从病变组织、器官上脱落的细胞。经常地，目标细胞在在上述体液中的含量非常稀少。
[0003]例如，循环上皮细胞是存在于血液中的一种稀有细胞，从病变的上皮组织脱落，其中从良性病变组织脱落的为良性上皮细胞，从恶性病变组织(癌症)脱落的为肿瘤细胞，其数目极其稀少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和 500 亿个红细胞(Zhe XN, Cher ML, Bonfil RD, Am.J.Cancer Res.2011，1，740-751)，对其检测犹如大海捞针。除了血液之外，一些组织液中也含有从病变组织脱落的具有诊疗价值的细胞，如腹水、胸腔积液、脑脊液等中的肿瘤细胞。此外，孕妇外周血中也可检测到来自胎儿的有核红细胞，收集这些胎儿的稀有细胞能够获得胎儿完整的基因组，从而为产前诊断遗传病提供有力的工具。
[0004]下面以血液中循环上皮细胞为例概述目前一些稀有细胞富集方法。从血液中富集循环上皮细胞的方法按照富集方式可分为正选或负选，按照富集原理可分为基于细胞表面标志物或基于细胞的物理性质。
[0005](1)正选+细胞表面标志物:这一方法主要通过针对上皮细胞特异性标志物(如EpCAM, EGFR, HER2等)的抗体来富集血液中的上皮来源细胞，抗体可修饰于免疫磁球表面或微流控芯片通道表面，其中最具代表性的是已被美国FDA批准应用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中循环肿瘤细胞的Cell Search?系统(CristofanilliM, Budd T, Ellis MJ, et al.N.Engl.J.Med.2004, 351, 781-791 ；Riethdorf S, FritscheH, Muller V, et al.Clin.Cancer Res.2007, 13, 920-928 ；Cohen SJ, Punt CJA, IannottiN, et al.J.Clin.0ncol.2008, 26，3213-3221)，该系统运用标记有EpCAM抗体的磁性微球进行血液中循环肿瘤细胞的富集，但这一方法难以捕获不表达或低表达EpCAM的上皮细胞，即使使用若干种针对不同抗原的抗体进行联合捕获也依然存在上述问题。
[0006](2)正选+细胞物理性质:这一方法主要是利用肿瘤细胞与血细胞尺寸上的差异进行富集。红细胞明显小于上皮来源的细胞，而白细胞虽然平均尺寸小于上皮细胞，但是数量巨大的白细胞其尺寸分布很宽，且上皮细胞尤其是肿瘤细胞异质性较大，因此部分白细胞与循环上皮细胞的尺寸存在重叠。通过这一方法分离的循环上皮细胞中往往混入大量白细胞，获得样本的纯度很低，难以进行后续的分子分析。同时，由于肿瘤细胞的异质性，存在着一些尺寸较小的肿瘤细胞容易被漏选从而造成损失。
[0007](3)负选:这一方法主要是为解决正选难以富集到血液中全体游离的循环上皮细胞而采用的，其富集策略是将血液中已知的血细胞分步去除，从而剩下的细胞悬液中包含了我们所需要的循环上皮细胞。基本的方法是首先通过密度梯度离心去除血液中的红细胞及部分白细胞，取单个核细胞层与修饰了 CD45抗体的免疫磁球孵育(CD45是白细胞表面共同抗原)，然后通过施加磁场截留表面结合了 CD45磁球的白细胞，同时收集剩余的细胞悬液，其中包含了所需要的循环上皮细胞，最后通过离心浓缩这一稀有细胞悬液并进行后续分析。但之前的研究证实这一方法的对上皮细胞的回收率很低，因此一直不是主流的稀有细胞富集方法。
[0008]由于稀有细胞难以高收率的筛选和富集，导致对其检测分析困难。因此需发展高效、快速的将稀有细胞从例如血液这类极为复杂的生物样本中富集出来的工具与方法，达到回收率收集稀有细胞的目的。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的正是稀有细胞负选回收率低的问题。
[0010]本发明的第一方面是一种稀有细胞富集装置，其包括:细胞筛选部分，其包含形成在两个相对表面之间的细胞筛选通道，两个相对表面中的至少一个表面为磁性吸附表面，其中所述细胞筛选通道的厚度设置为，当细胞悬液流经时形成为使得细胞基本上以单层分布的薄液层，从而结合了免疫磁球的多数细胞在所述细胞筛选通道内被吸附到所述磁性吸附表面时避免裹挟稀有细胞。所述装置还包括:细胞收集部分，其包含过滤单元，其可拆卸地设置于所述细胞筛选部分的下游，以截留未被磁性吸附的稀有细胞。
[0011]本发明的第二方面是一种富集稀有细胞的方法，包括:制备包含多数细胞和稀有细胞的细胞悬液，其中所述多数细胞结合有免疫磁球；使所述细胞悬液以细胞基本上呈单层分布的薄液层形式流过磁性吸附表面，其中结合了免疫磁球的多数细胞被吸附到所述磁性吸附表面；及用微滤膜截留细胞悬液中未被吸附的稀有细胞，以收集未被吸附的稀有细胞。
[0012]当含有目标稀有细胞以及结合有免疫磁球的多数细胞悬液从流经细胞筛选通道时，由于流过通道的适当稀释细胞悬液的液层很薄，细胞基本上以单层形式存在，表面结合磁球的细胞被吸引到磁性表面的时候不会裹挟稀有的循环上皮细胞。另外，用微滤膜截留未被吸附的稀有细胞可以提高稀有细胞回收率，克服离心浓缩稀有细胞悬液带来的回收率低的问题。本发明解决了通过负选富集稀有细胞时容易导致稀有细胞丢失这两个关键问题，因此能获得较高的稀有细胞回收率，这也正是本发明的创新之处。
【附图说明】
[0013]图1是根据本发明【具体实施方式】的稀有细胞富集装置的原理图；
[0014]图2是根据本发明【具体实施方式】的稀有细胞富集装置的三维图；
[0015]图3是用于本发明稀有细胞富集装置的用于收集稀有细胞的双层滤膜示意图；及
[0016]图4是图3所述滤膜截留了细胞的照片。
[0017]附图标记的说明:1.稀有细胞富集装置；2.磁性部；2A.内管；2B.磁体；3.外管；4.进样口 ；5.出样口 ；6.滤膜；7.集液瓶；8.抽气口 ；9.填充物 '及C.细胞筛选通道。
【具体实施方式】
[0018]参见图1和图2，它们示出了本发明一【具体实施方式】的稀有细胞富集装置的原理图和三维图。本发明的稀有细胞富集装置1具有主体部分或细胞筛选部分，其包括磁性部2和套在磁性部2外的外管3。磁性部2可包括内管2A和容纳其中的磁体2B。磁性部2的外壁与外管3的内壁，也即内管2A的外表面与外管3的内表面，共同界定细胞筛选通道C。主体部分的上、下两端分别形成有与细胞筛选通道C液体联通的进样口 4和出样口 5。因此，本发明的这一实施方式中，富集装置的筛选部分大体形成为内含磁体的双层套管结构。
[0019]例如，内管2A和外管3分别采用的材料为聚苯乙烯或亲水凝胶包被的聚苯乙烯或其他对细胞不吸附或超低吸附的材料。磁体2B可以是由一个或多个永磁体组合成的圆柱状的磁体。但本发明不限于此。
[0020]内管2与外管3的管壁间距(即沿管壁纵向延伸的通道C的宽度)设置为，当细胞悬液流过通道C时形成的液层很薄，使得悬浮细胞基本上以单层分布。为了使悬浮细胞在通道C中以单层分布，可根据悬浮液中细胞尺寸和悬浮细胞密度来确定通道C的宽度为0.1mm - 5mm，优选为0.lmm-lmm。在本发明实施例2中，对于从作为多数细胞的白细胞中筛选出作为稀有细胞的循环上皮细胞时实际使用的富集装置中，通道C