一种制备蜀葵单倍体细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种制备植物单倍体材料的方法，特别是设及一种制备蜀葵单倍体材 料的方法。
【背景技术】
[0002] 蜀葵，又称一丈红，为锦葵科蜀葵属多年生草本植物。蜀葵全株入药，有很大的药 用价值，具有清热解毒、镇咳利尿的功效。蜀葵花中含有大量花青素，可作为食用着色剂。蜀 葵花呈总状花序顶生单瓣或重瓣，有紫、粉、红、白等色，颜色亮丽、清新，具有极大的观赏价 值，可种植在庭院W及公园内，同时蜀葵对二氧化硫、氯化氨等具有较强抗性，是优良的城 市景观植物，已经培养出了千叶、五屯、、重台、剪绒、银口等名贵品种。由于其出色的药用、观 赏、及城市绿化价值，近年来对蜀葵的需求量也越来越大。
[0003] 单倍体细胞可W用来培育单倍体植株，培育新品种，获得纯系育种材料和进行单 倍体育种，缩短育种年限和提高育种效率。另外在发酵动力学方面，利用单倍体材料建立 单细胞悬浮体系用来进行单倍体细胞在植物细胞悬浮培养中的动力学研究，探索单倍体细 胞在植物悬浮培养中的优势。然而自然界中自然产生单倍体的频率一般是很低的，仅在 0. 002%~0. 02%之间，依据植物细胞全能性，利用花药培养来获得单倍体材料成功的解决 了运一问题，目前已经有200多种具有经济价值和观赏价值的植物通过花药培育获得了单 倍体，其中W茄科和禾本科居多，然而有关蜀葵乃至锦葵科植物方面花药培养的报道几乎 没有。因此非常有必要提供一种方法来验证花药培养在蜀葵乃至锦葵科植物中的可行性， 并获得单倍体细胞。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种利用花药培养制备蜀葵单倍体细胞的方法。 阳005]本发明的技术方案概括如下。
[0006] 一种利用花药培养制备蜀葵单倍体细胞的方法包括W下步骤：
[0007] (1)蜀葵花蕾采摘和预处理：五月底，采集尚未开放的蜀葵花蕾，镜检花粉鉴定花 药发育时期处于单核中期或者后期。并放入4°c冰箱进行低溫预处理24~72h。
[0008] (2)蜀葵花药培养：将预处理的花蕾用自来水冲洗比，用浓度为2%~10%得次氯 酸钢浸泡lOmin~25min。用无菌水冲洗后，在超净台上剥开花蕾取出花药用75%酒精冲 洗20~30s，然后用无菌水反复冲洗干净，再用无菌滤纸吸干多余水分，接种于固体培养基 上。在生化培养箱中25~27°C溫度条件下暗培养20d左右即可得到愈伤组织。继代培养 3~5次。
[0009] 做流式细胞术鉴定不同倍性细胞：从的愈伤组织上切下300~500mg的愈伤，放 在提前预冷的平皿上，加入解离缓冲液2ml，用刀片快速切碎，整个过程在冰上操作。在4°C 下解育lOmin，用200目筛子过滤，2000r/min离屯、5min，弃上清，加入400ul浓度为50ug/ ml的PI(含RNA酶A)后在4°C下避光染色20min，用500目筛子过滤，收集滤液利用流式细 胞仪测定。处理数据统计其中单倍体细胞和多倍体细胞的数目和比例。
[0010]蜀葵花药愈伤诱导固体培养基为在MS培养基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、 6-节氨基嚷岭、薦糖和琼脂，使2,4二氯苯氧乙酸的终浓度为1~3111旨/1、糞乙酸的最终浓 度为0~2mg/l、6-节氨基嚷岭的终浓度为1. 5mg/l、薦糖终浓度为30/L、琼脂终浓度为6g/ L，抑=5. 8-6. 0。 W11] 流式细胞术应用的解离缓冲液为Ga化raith缓冲液：45mmol/L MgCl2、30mmol/L， sodium citrate(巧樣酸钢）、20mmol/L M0PS(4-丙横酸基吗嘟）和0.1% (w/v)T;riton X-100,去离子水定容至200血，pH7. 0 阳01引本发明的优点
[0013] 本发明利用花药培养得到蜀葵单倍体细胞，首次验证了通过花药培养得到单倍体 细胞在蜀葵乃至锦葵科植物上应用的可行性。且不受外部条件限制，操作相对简单，成本低 廉，重复性好，诱导速度快，得到的愈伤生长快、长势好。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0015] 花药愈伤诱导率=(诱导出愈伤组织的花药数/总接种花药数）X 100%。
[0016] 实施例1
[0017]固体培养基的制备：在MS培养基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-节氨基嚷 岭、薦糖和琼脂，使2,4二氯苯氧乙酸的终浓度为Img/l，糞乙酸的最终浓度为Omg/l，6-节 氨基嚷岭的终浓度为1. 5mg/L，薦糖终浓度为30g/L，琼脂终浓度为6g/l，调抑=5. 8,在 12rC，0.IMpa压力的条件下灭菌25分钟，冷却至常溫，备用。 阳〇1引实施例2
[0019]固体培养基的制备：在MS培养基中加入2，4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-节氨基嚷 岭、薦糖和琼脂，使2,4二氯苯氧乙酸的终浓度为Img/l，糞乙酸的最终浓度为Img/l，6-节 氨基嚷岭的终浓度为1. 5mg/L，薦糖终浓度为30g/L，琼脂终浓度为6g/l，调抑=5. 8,在 12rC，0.IMpa压力的条件下灭菌25分钟，冷却至常溫，备用。
[0020] 实施例3
[0021]固体培养基的制备：在MS培养基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-节氨基嚷 岭、薦糖和琼脂，使2,4二氯苯氧乙酸的终浓度为Img/l，糞乙酸的最终浓度为2mg/l，6-节 氨基嚷岭的终浓度为1. 5mg/L，薦糖终浓度为30g/L，琼脂终浓度为6g/l，调抑=5. 8,在 12rC，0.IMpa压力的条件下灭菌25分钟，冷却至常溫，备用. 阳0巧实施例4
[0023] 固体培养基的制备：在MS培养基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-节氨基嚷 岭、薦糖和琼脂，使2,4二氯苯氧乙酸的终浓度为2mg/l，糞乙酸的最终浓度为Omg/l，6-节 氨基嚷岭的终浓度为1. 5mg/L，薦糖终浓度为30g/L，琼脂终浓度为6g/l，调抑=5. 8,在 12rC，0.IMpa压力的条件下灭菌25分钟，冷却至常溫，备用.
[0024] 实施例5
[00巧]固体培养基的制备：在MS培养基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-节氨基嚷 岭、薦糖和琼脂，使2,4二氯苯氧乙酸的终浓度为2mg/l，糞乙酸的最终浓度为Img/l，6-节 氨基嚷岭的终浓度为1. 5mg/L，薦糖终浓度为30g/L，琼脂终浓度为6g/l，调抑=5