靶向o-乙酰化的gd2神经节苷脂作为针对癌症干细胞的新型治疗和诊断策略的制作方法
【技术领域】
[0002] 本发明设及用于治疗和/或诊断癌症干细胞（CSC)癌的抗体、药物组合物和方法。
【背景技术】 阳00引 癌症干细胞
[0004] 最近数十年来医学研究的发展使现有的癌症治疗策略取得了重要的改善。在不 断的研究和应用包括化疗、放疗、激素疗法和外科手术的常规治疗策略的同时，出现了通常 被称为"祀向癌症治疗"的新的癌症控制方法并显示出其在医疗领域的效率和利益。运些 祀向疗法包括针对肿瘤抗原的单克隆抗体，例如曲妥珠单抗（抗-Her2Neu)、利妥昔单抗 (抗-CD20))或贝伐单抗（抗-VEGF)，W及酪氨酸激酶抑制剂（例如，伊马替尼、厄洛替尼、 吉非替尼）、CDK抑制剂等。运些新的癌症治疗方案在很大程度上改善了患者的生活，并且 相比于多数常规策略具有增加的存活率和减小的副作用。然而，运些祀向治疗策略也迅速 显示出局限性，尤其是由于对所述治疗的抗性，W及运些祀向治疗的特异性，其并不是对于 每一种类型的癌症和患者都是有效的。运些抗性治疗现象导致治疗失败、出现转移、再发和 复发。
[0005] 研究表明，运些抗性的根本原因可能是癌症干细胞（CSC)的存在，其是能够自我 更新和分化的癌细胞的一个小亚组，并且在癌症抵抗、复发和转移中起根本性作用。事实 上，运些癌症干细胞显示出对于癌症治疗（包括放疗和化疗）的相对抵抗。此外，仅仅少量 的运些癌症干细胞就足W引发新的肿瘤，并由此发生转移。因此，直接祀向运些癌症干细胞 可W改善目前癌症治疗策略的效力。
[0006] 由此已经深入研究了癌症干细胞和相关的机制。已经研究了鉴定运样的癌症干细 胞的方法，并且发现了几种CSC标志物。遗憾的是，仍然没有被鉴定为可用于许多癌症类型 的CSC标志物的抗原。目前使用CSC标志物的实例包括ALDH、CD133、CD44、CD24、CD166。 在不同类型的癌症中，已鉴定了许多不同表型为CSC表型。尤其是，现今CD133被广泛用作 癌症干细胞的标志物，其在神经胶质瘤中表现出是良好的CSC标志物。
[0007] 现在，细胞表型CD133+与神经胶质瘤中的癌症干细胞相关；表型CD44 +CD24 显 示出与乳腺癌中的癌症干细胞相关；表型CD34+显示出与白血病中的癌症干细胞相关；更 具体地，CD347CD38与急性髓细胞白血病中的癌症干细胞相关；W及表型CD347CD19+显示 出与急性淋己细胞白血病中的癌症干细胞相关。
[0008] 遗憾的是，大多数已知的CSC标志物在正常组织中也表达。因此，最关注的是确定 能够被用作诊断和治疗CSC标志物的特定癌症标志物：其能够出于诊断目的而被祀向，并 且还能够用于治疗包含癌症干细胞的癌症（本文中称为癌症干细胞癌症（CSC癌）），而不会 出现由于对健康细胞的毒性而造成的副作用。
【发明内容】
[0009] 本发明的发明人已经示出了神经外胚层起源的癌症特异性表达GD2-0-乙酷化的 神经节巧脂，并且能够通过给药祀向GD2-0-乙酷化的神经节巧脂的治疗性抗体而显示出 有益效果，且不具有神经毒性，尤其是由于该癌症抗原在健康细胞上不表达，尤其是在外周 神经上不表达。
[0010] 现在，发明人出人意料地示出了该GD2-0-乙酷化的神经节巧脂在癌症干细胞中 强烈表达，并且能够被祀向W用于CSC癌治疗。
[0011] 因此，发明人提出了利用特异于0-乙酷化的-GD2神经节巧脂的8B6抗体（和其 衍生物）祀向0-乙酷化的-GD2神经节巧脂W用于治疗CSC癌。
[0012] 在其研究中，他们证明了该抗体显示出针对肿瘤细胞的固有强效细胞毒活性，除 了免疫效应（包括CDC和ADCC)之外，还包括通过细胞调亡或其他细胞死亡通路的直接细 胞毒性。
[0013] 因此，本发明设及用于治疗治疗癌症干细胞（CSC)癌症的识别0-乙酷化的-GD2 神经节巧脂的抗体，或其功能性片段，所述抗体包含：
[0014] a)轻链，至少包含来自免疫球蛋白的轻链可变区框架和由序列SEQIDNO: 1、SEQ IDN0:2、SEQIDN0:3限定的Ξ个互补决定区（CDRs)，其中序列沈QIDN0:1限定CDR-Ll， 沈QIDN0:2 限定CDR-L2,SEQIDN0:3 限定CDR-L3,和 / 或
[0015] b)重链，至少包含免疫球蛋白的重链可变区框架和由序列SEQIDN0:4、SEQID N0:5、SEQIDN0:6限定的Ξ个互补决定区（CDRs)，其中序列沈QIDN0:4限定CDR-Hl，沈Q IDN0:5 限定CDR-肥，沈QIDN0:6 限定CDR-册。
[0016] 本发明还设及用于治疗CSC癌的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗 体。
[0017] 本发明进一步设及用于诊断受试者中CSC癌的方法，其中所述方法包括确定0-乙 酷化的-GD2神经节巧脂的表达，并且其中该0-乙酷化的-GD2神经节巧脂的表达是CSC癌 的指征。
[0018] 本发明还设及0-乙酷化的-GD2神经节巧脂作为CSC癌的生物标志物的用途。
[0019] 最后，本发明设及预测患有CSC癌的受试者对用本发明的抗体或组合物进行的 治疗的应答的方法，其中所述方法包括检测所述受试者的生物学样品中表达0-乙酷化 的-GD2神经节巧脂的细胞的存在。
【附图说明】
[0020] 图1 :用对照IgG3抗体作为阴性对照染色的胶质母细胞瘤切片的代表性照片（A); 用mAb8B6染色的神经母细胞瘤肿瘤切片度）。根据mAb8B6染色的比强度（specific intensity)对胶质母细胞瘤样品进行评分1+(C)、化值）、3+胆)、和4+胆)。 阳02U 图2 :0AcGD2在人胶质母细胞瘤癌细胞中鉴定了CD133可细胞表型。UL，左上角， 0ACGD2+U87MG人胶质母细胞瘤细胞；UR，右上角，CD133+0AcGD2+U87MG人胶质母细胞瘤细 胞；LL，左下角，CD133 0AcGD2U87MG人胶质母细胞瘤细胞；LR，右下角，CD133+U87MG人胶质 母细胞瘤细胞。
[0022] 图3 :暴露于50μg/ml对照抗体或mAb8B6的U87MG人胶质母细胞瘤细胞的相差 显微镜检查。在24小时的解育期后，在相差显微镜下W相同的放大率X200观察由形态变 化评价的调亡细胞。箭头指示调亡细胞。
[0023] 图4 :抗-0AcGD2mAb在小鼠中抑制人胶质母细胞瘤生长。
[0024] 图5 :抗-GD2和抗-0AcGD2抗体对乳腺癌细胞的细胞毒性。在逐渐增加的鼠 抗-GD2 (10B8)和抗-0AcGD2 (8B6)抗体浓度下通过MTT测定来评价直接细胞毒性。 阳0巧]图6 :小细胞肺癌中CSC中0AcGD2的表达。同时具有0AcGD2 (8B6)或GD2 (10B8) 的CD133 (CSC)的H196细胞系的流式细胞术中的表达谱。
【具体实施方式】
[0026] 本发巧的治疗策略
[0027] 本发明的第一个目的设及用于治疗癌症干细胞（CSC)癌的识别0-乙酷化的-GD2 神经节巧脂的抗体，或其功能性片段，所述抗体包括： 阳02引 a)轻链，至少包含来自免疫球蛋白的轻链可变区框架和由序列SEQIDNO: 1、SEQ IDN0:2、SEQIDN0:3限定的Ξ个互补决定区（CDRs)，其中序列沈QIDN0:1限定CDR-Ll， 沈QIDN0:2 限定CDR-L2,SEQIDN0:3 限定CDR-L3,和 / 或
[0029] b)重链，至少包含来自免疫球蛋白的重链可变区框架和由序列SEQIDNO:4、SEQ IDN0:5、SEQIDN0:6限定的Ξ个互补决定区（CDRs)，其中序列沈QIDN0:4限定CDR-Hl， 沈QIDN0:5限定CDR-肥，沈QIDN0:6限定CDR-册。
[0030]
[0031] 所述CDR根据IMGT系统命名法来定义，其是本领域公知的（TheInternational ImmunogeneticsInformationSystem巧、LEFRANC等人，NucleicAcidsResearch,vol. 27 ,p:209-212, 1999)〇
[0032] 术语"抗体"作为其本领域一般含义是指对应于包含四条肤链的四聚体免疫球蛋 白分子，运四条肤链为通过二硫键相连的两条完全相同重（H)链（全长为约50-70kDa)和 两条完全相同的轻（L)链（全长为约25kDa)。轻链被分类为K和λ。重链被分类为丫、 μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、I曲和I姐。每条重链由N-端 重链可变区（在本文中缩写为HCVR)和重链恒定区组成。对于IgG、I曲、和IgA,重链恒定 区由Ξ个结构域（CHI、C肥、和C册）和较链区组成；对于IgM和I姐，重链恒定区由4个结 构域（CH1、C肥、C册、和CH4)组成。每条轻链由N-端轻链可变区（在本文中缩写为LCVR) 和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域（CL)组成。HCVR和LCVR区能够进一步细 分为高度可变的区域，被称为互补决定区（CDR)，散置有更加保守的区域，其被称为框架区 (FR)。每个肥VR和LCVR由Ξ个CDR和四个FR构成，W如下顺序从氨基端至簇基端排列： FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。根据公知规则为每个区域分配氨基酸。抗体结合于 特定抗原的功能性能力取决于每个轻链/重链对的可变区，并且在很大程度上由CDR决定。
[0033] 在一种特定的实施方式中，本发明的抗体包含：
[0034] a)轻链，包含来自免疫球蛋白的轻链框架和由序列SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、 沈QIDN0:3限定的Ξ个互补决定区（CDRs)，其中序列沈QIDN0:1限定CDR-Ll，沈QID N0:2 限定CDR-L2,SEQIDN0:3 限定CDR-L3,和 / 或
[0035] b)重链，包含来自免疫球蛋白的重链框架和由序列SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、 SEQIDN0:6限定的Ξ个互补决定区（CDRs)，其中序列沈QIDN0:4限定CDR-Hl，沈QID NO:5限定CDR-肥，沈QIDNO:6限定CDR-册。
[0036] 在更特定的实施方式中，本发明的抗体包含包括氨基酸序列SEQIDNO:7的轻链 可变区化CVR)和包括氨基酸序列SEQIDNO:8的重链可变区化CVR)。所述抗体为8B6抗 体。
[0037]
[0038] 如本文中使用的，术语"抗体"本质上是指单克隆抗体。单克隆抗体可W是人抗 体、嵌合抗体和/或人源化抗体。
[0039] 如本文中使用的，术语"功能片段"是指能够识别0-乙酷化的-GD2神经节巧脂的 抗体片段。本领域技术人员能够简单地识别或生产运样的片段，其包括：举例而言，Fgb片段 (可由木瓜蛋白酶消化产生）、Fgb'片段（可由胃蛋白酶消化和部分还原产生）、尸(。,'）2片段 (可由胃蛋白酶消化产生）、F。。,（可由血浆酶消化产生）、Fd(可由胃蛋白酶消化、部分还原 和重聚合产生），W及SCFy(单链Fy，由分子生物学技术产生）片段、双价抗体和单价抗体。
[0040] 术语"双价抗体"是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接于 相同多肤链（VH-化）中的轻链可变区（VL)的重链可变区（VH)。优选地，通过利用太短W 使得同一条链上的运两个结构域之间不能够配对的接头，将运两个结构域与另一条链的互 补结构域强行配对并产生两个抗原结合位点。
[0041] 如本文中使用的，术语"单价抗体"是指抗原结合分子，其具有重链可变结构域 而