高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高产孢子的木霉菌T23-〇vell菌株及其 构建方法。
【背景技术】
[0002] 木霉生防制剂是以木霉菌分生孢子、菌丝体或厚垣孢子等为主要成分，用于防 治某些植物病原菌促进植物生长具有重要的生物防治价值的木霉菌剂。目前生产上常 用的木霉菌剂多为分生孢子制剂，将木霉发酵制成的孢子制剂进行种子包衣或土壤处 理，可以有效地防治苗期病害。早在1981年西欧国家已进行木霉菌制剂商品化生产，而 我国江浙地区也早使用木霉菌制剂防治茉莉花白絹病。目前木霉生防制剂占全世界生 防制剂市场的60%，截止2012年国内外已经登记的木霉菌制剂所用菌株主要包括棘孢 木霉（T.asperellum)、深绿木霉（T.atroviride)、哈茨木霉（T.harzianum)和绿色木霉 (T.viride)4个种的菌株共50多种，其中的多数木霉菌制剂用于植物土传病害的防治，如 立枯丝核菌、镰刀菌、疫霉、腐霉等。其中，后期商品化程度较高的木霉菌制剂主要有美国 的Topshield(T.harzianumT-22)、以色列的Trichodex(T.harzianumT39)及Makhteshim Agan公司的Trichodex木霉菌制剂等。
[0003] 木霉菌能在其生长周期内三种不同的繁殖体一一菌丝体、分生孢子和厚垣孢子， 将木霉生防制剂按成分分为菌丝体制剂、分生孢子制剂和厚垣孢子制剂。菌丝体制剂可在 土壤中迅速生长，制剂储存和活化过程不必保持无菌条件，但使用不方便，储存期短；分生 孢子制剂是目前商品化程度最高的木霉制剂，主要优点是产量高、易培养，但其货架期较 短；而厚垣孢子制剂，由于厚垣孢子具有耐干燥、耐低温、对土壤抑菌作用不敏感，存活期 长，易加工储藏。因此木霉菌剂的孢子活性和数量一直是木霉菌剂商业化发展的瓶颈和障 碍。
[0004] 为了获得高产孢子的木霉菌剂，目前已有的研究多是发酵工艺的改进，从培养基 成分和培养条件两方面共同提高孢子产量和活力，庄敬华等（2005)研究表明通过控制木 霉菌在液体发酵中的温度和pH值，有利于产生分生孢子。而张广志等（2013年）发现： 秸杆的细度对木霉产分生孢子有影响，粗基质有利木霉产孢，基质的细度在10-40目时木 霉孢子产量最大；适量含水量对木霉产分生孢子有显著影响，发酵培养基含水量调整在 60% -70%对木霉产分生孢子最为适宜；接种后静止培养有利于木霉产分生孢子。而培养 工艺上的改进缺少普遍适应性，加大实际生产中的难度，且实验培养基取材地的差异影响 试验结果的稳定性。随着木霉菌分子生物学研究的深入，尤其是发现木霉菌中存在veil编 码的Velvet蛋白，其作为转录因子显著的调控其生长和发育，影响孢子的形成，这一发现 为从遗传水平上改进木霉菌发酵产生孢子的数量和活力提供了可控制的方向。并且利用改 良的ATMT遗传转化技术，在木霉菌中过表达veil基因，实现veil基因调控的孢子的形成 数量和活力明显增加。需要指出的是，基因的过表达是常规的概念，但不同的过表达构建方 式不同，且基因过表达后也不一定都能高产孢子，要经过筛选和鉴定。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种高产孢子的木霉菌T23_0vell菌株及其构建方法。 为了提高木霉菌在液体发酵时的产量，解决传统的培养条件和工艺的优化提高幅度小，不 稳定等缺陷，本发明旨在利用分子遗传手段获得高效稳定产孢子的木霉菌株，基于木霉菌 Veil基因调控其分生孢子和厚垣孢子的形成，本发明构建深绿木霉菌T23的veil基因过表 达株，筛选鉴定获得孢子产量高且稳定遗传的高效生防木霉菌株，提高以木霉菌孢子为主 要成分的木霉菌菌剂在农业中的防病效果。
[0006] 本发明涉及的深绿木霉菌T23_0vell菌株为深绿木霉（Trichodermo. atroviride)，已经于2015年11月3日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCCN0:11575。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 第一方面，本发明涉及一种高产孢子的深绿木霉菌T23_0vell菌株的构建方法， 所述方法包括如下步骤：
[0009]S1、深绿木霉菌T23的veil基因过表达框的构建：利用重叠PCR方法在深绿木霉 菌T23的veil基因编码框前融合色氨酸强启动子，在veil基因编码框后融合色氨酸终止 子，获得所述veil基因过表达框；
[0010]S2、利用改良的ATMT转化获得木霉菌T23-〇vell菌株：通过改良的农杆菌介导的 遗传转化方法（ATMT)将所述vel1基因过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中，获得转化 子；对所述veil基因过表达转化子进行验证、筛选，获得所述深绿木霉菌T23-〇vell菌株。
[0011] 优选的，步骤S1中，先将长318bp的色氨酸强启动子与veil基因编码框融合，片 段回收后，再将融合色氨酸强启动子的片段与长252bp的色氨酸终止子融合。
[0012] 优选的，步骤S1中，所述构建具体为：使用高保真酶KODneoplus，以 pCAMBIA1300th质粒为模板分别扩增色氨酸强启动子和色氨酸终止子，以T23基因组DNA为 模板扩增veil基因，然后通过重叠PCR将三个扩增片段融合起来。
[0013] 优选的，所述扩增色氨酸强启动子采用的引物为pro-F和pro-R，所述pro-F的序 列如SEQIDNO. 1所示，所述pro-R的序列如SEQIDN0. 2所示。
[0014] 优选的，所述扩增veil编码基因采用的引物为ove-vell-F和ove-vell-R，所述 ove-vell-F的序列如SEQIDN0. 3所示，所述ove-vell-R的序列如SEQIDN0. 4所示。
[0015] 优选的，所述扩增色氨酸终止子采用的引物为term-F和term-R，所述term-F的序 列如SEQIDN0. 5所示，所述term-R的序列如SEQIDN0. 6所示。
[0016] 优选的，步骤S1中还包括利用高保真Taq酶克隆获得深绿木霉菌T23的veil基 因的步骤。
[0017] 优选的，步骤S2中，所述通过改良的农杆菌介导的遗传转化方法将所述veil基因 过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中具体包括：
[0018]A1、通过酶切酶连将所述veil基因过表达框与pCAMBIA1300th载体连接后，进行 大肠杆菌转化；
[0019]A2、挑取单克隆进行大肠杆菌菌落PCR验证，筛选阳性克隆提取veil基因过表达 载体，再进行农杆菌AGL-1转化；
[0020] A3、在含40mol/LMES和200mmol/LAS的頂诱导固体培养基中放入玻璃纸，静置 30min让水份吸干后，将含有veil基因过表达载体的农杆菌的菌液与深绿木霉菌T23孢子 悬浮液的等体积混合液涂布于玻璃纸上，于25°C培养箱共培养48h;
[0021] A4、待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产孢时，将玻璃纸转移至含300μg/mL的特 美汀与200μg/mL的潮霉素的頂培养基上，25°C培养5d长出转化子；
[0022] A5、挑选可能的转化子到含300μg/mL的头孢与200μg/mL的潮霉素的CYA培养 基，验证后在含头孢的CYA平板上传5代后，单孢分离再传一代后，设计引物PCR验证得到 阳性的转化子；
[0023] 即实现将所述Veil基因过表达框插入深绿木霉菌T23基因组DNA中。
[0024] 本发明采用上述改良的农杆菌介导的遗传转化方法成功地将所述veil基因过表 达框插入深绿木霉T23基因组DNA中，经鉴定，本发明获得的深绿木霉菌T23-〇vell菌株产 孢子量明显高于野生株。并且该菌株经过继代培养，其高产分生孢子性状能够稳定遗传， 为开发高效木霉菌生防菌剂提供优良的菌株资源。
[0025] 优选的，步骤A2中，所述筛选采用的培养基为含卡那霉素和利福平抗性的LB液体 培养基。
[0026] 采用含有特美汀和潮霉素的頂培养基（含300μg/mL的特美汀与200μg/mL的 潮霉素）。300ug/ml的特美汀的添加能抑制农杆菌的生长，减少农杆菌在侵染过程中阻力， 增加其侵染效率，提高转化效率及转化子的稳定性。
[0027] 优选的，所述含有300μg/mL特美汀和200μg/mL潮霉素的頂培养基包括如下 成分：10mMK2HP04、10mMKH2P04、2.5mMNaCl、2mMMgS04、0.7mMCaCl2、9mMFeS04,7H20、 4mM(NH4)2S04、10mM葡萄糖、40mMpH5.3 的MES、200mM甘油、1.4% (体积）琼脂、300yg/ mL特美汀和200μg/mL潮霉素。
[0028] 优选的，步骤A5中，所选择的筛选CYA培养基成分（每毫升）：NaN032g、 Κ2ΗΡ04 · 3H20lg、KCl0· 5g、MgS04 · 7H20 0· 5g、FeS04 · 7H20 0·Olg、蔗糖 3