一种用于竹节参分子鉴定的引物及序列特异扩增区域（scar）的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分子鉴定方法，具体为对竹节参的序列特异扩增区域标记分子鉴 定方法。
【背景技术】
[0002] 竹节参为五加科人参属植物竹节参PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖，具 有滋补强壮、散瘀止痛、止血、祛痰的功效，用于病后虚弱，劳嗽咯血，咳嗽痰多，跌扑损伤， 因此兼具我国北药人参的滋补强壮和南药三七的活血散瘀的作用，是我国西南地区土家 族、苗族等聚居区常用中草药。人参属植物人参PanaxginsengC.A.Mey.、西洋参Panax quinquefoliumL.、三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen等均以根莖入药，中药饮片 外观与竹节参相似，易造成混用。因此，寻找有效方法鉴别这些药材，对于合理用药具有重 要意义。
[0003] 与传统中药鉴定技术相比，DNA分子标记技术是直接利用植物DNA分子水平上 的差异来进行鉴别，其结果不受植物生长年限、生理状态以及生长环境的影响，更加客观、 可靠。目前已有多种DNA分子标记技术应用于植物的鉴别中，如随机扩增多态性DNA标 记（RandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)、限制性片段长度多态性（Restriction fragmentlengthpolymorphism，RFLP)、单核苷酸多态性（Singlenucleotide polymorphism，SNP)、内转录间隔区（Internaltranscribedspacer，ITS)等。序列特异扩 增区域（Sequencecharacteredamplifiedregion，SCAR)标记技术是在RAPD基础上发展 起来的一种稳定性更高、特异性更强的分子标记，已应用于一些近缘物种的鉴别。
【发明内容】
[0004] 本文旨在建立一种SCAR分子标记技术，用于快速准确鉴别竹节参及其近缘植物 人参、西洋参以及三七。具体包括如下内容：
[0005] 植物样本包括如下：
[0006] 竹节参新鲜叶片采购于湖北恩施椿木营竹节参种植生产基地，三七的新鲜叶片采 购于云南文山砚山县者腊乡，人参、西洋参的新鲜叶片购自于吉林省白山市靖宇县。采集后 用硅胶迅速干燥备用。
[0007] 试剂包括如下：
[0008] PCR扩增试剂（ThermoScientific公司）、CTAB(AMRESC0 公司）、PVP40(Sigma公 司）、琼脂糖（BI0WEST公司）、GelRed染料（BI0TIUM公司）、RNaseA(Sigma公司）、DNA上 样缓冲液（武汉科瑞生物技术有限公司）、2XTaqPCRMastermix【天根生化科技（北京） 有限公司】、lkbplusDNALadder【天根生化科技（北京）有限公司】。RAPD随机引物由上 海生工公司合成。其余试剂均为分析纯。
[0009] 仪器包括如下：
[0010] BS110S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、HH-4数显恒温水浴锅（常 州国华电器有限公司）、CT15RT高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备工程有限公司）、 梯度PCR仪（AppliedBiosystems)、DYY_6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、GeneGenius 凝胶分析系统（英国SYNGNE公司）、LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪 器有限公司）。
[0011] 通过转化RAH)分析结果从而获得SCAR标记，步骤如下：
[0012] 基因组DNA的提取：用液氮将研钵、大小杵，药匙预冷，称取200mg叶片和10% PVP(W/W)置于液氮中，迅速研磨成细粉；将研磨好的细粉转移至1. 5mL离心管中，迅速加 入4°C预冷的700μL去多糖buffer，混勾，在冰上静置30min，4°C3000r·η?η1离心5min， 弃上清，此步骤重复一次，弃上清，加入700μL65 °C预热的2XCTAB提取液，65 °C水浴 40min，每隔lOmin轻轻上下颠倒混勾一次，取出1. 5mL离心管，冷却至室温，12000r·min1 离心lOmin;取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇的混合液，混匀lOmin，12000r·min1离心 10min，取上清，重复此步骤一次，取上清至新的1. 5mL离心管，加入0. 6倍体积的-20°C预 冷的异丙醇，混匀，于_20°(：静置111，4°(： 1200(^*1^111离心101^11，沉淀用70%乙醇洗涤 2次，无水乙醇洗涤1次，用吹风机冷风吹干液体，干燥后，加入30μL灭菌ddH20和0. 5μL RNaseA，37°C水浴lh，于-20°C保存备；
[0013]RAPD-PCR反应：使用随机引物H03 (序列为5 ' -AGACGTCCAC-3 '）对基因组DNA 进行PCR扩增。PCR反应液总体积为25yL，其中含MgC123yL、10XTaqbufferwith KC12.5yL、Taq酶 1.5yL、dNTPMixture0.5yL、引物 2yL、模板DNAlyL，加灭菌ddH20 补齐至25μL;MgC12浓度为25mM、Taq酶浓度为1U/μL、dNTPMixture浓度为10mM、引物 浓度为10mM。RAPD-PCR反应液扩增上述DNA程序为94°C预变性5min;94°C变性45s，36°C 退火60s，72°C延伸90s，循环39次；72°C补充延伸7min，每次PCR反应均设不含模板DNA的 空白对照，重复三次，以确定扩增产物的稳定性；
[0014] RAPD产物特异片段的纯化、克隆及测序：在紫外灯下将竹节参特异性DNA条带 (大约300bp)切下，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行特异性DNA条带的回收和纯化，回收的 DNA片段用pMD18-Tvector载体连接，转化导入E.coli感受态细胞中，细菌培养后挑选阳 性克隆提取质粒，将质粒酶切电泳确定阳性克隆，进行测序，测序结果如下：
[0015] 1GAATTCGATTAGACGTCCACATGGGCTAAAAAAATTAAATTATTTTATTACTCCTTTATC
[0016] 61TCTAGATTTTTCATATAATGCAACCCTTAGGATTTACACAATTAATTTTCTAAAATTTCT
[0017] 121AATTTAGGCTTTAAAAATAAGAATTTAATCTTTCTAACTTATAATTAGAATTTTCTAATT
[0018] 181ATATCAAAATCTCTTTATCATAATTTAAATATTACTAATTATGATTAACATTTCTTAATT
[0019] 241AAAATCGCTAATTTAGCAATTCGGGTCAAAACGGTCATTAGGGTTTATAAACCAATAATT
[0020] 301AGTATTTTCTAACTTAACGTGGACGTCTAATCACTAGTGAATTC
[0021] SCAR引物设计：根据测序结果和引物设计原贝IJ，应用Primer5. 0软 件设计特异性引物一对，引物Z1，其序列为：F5' -AGACGTCCACATGGGCTA-3' ； R5' -TAGACGTCCACGTTAAGTTAG-3'。
[0022] 应用SCAR标记技术鉴别竹节参，步骤如下：
[0023] 应用特异性SCAR引物Z1对竹节参及其它人参属植物基因组DNA进行PCR扩 增，SCAR-PCR反应体系为：模板DNAlyL，2XTaqPCRMastermix12. 5yL，上下游引物各 1μL，加灭菌ddH20补齐至25μL，其中，上下游引物浓度均为10mmol/L。SCAR-PCR扩增程序 为94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循环34次；72°C补充延伸 51^11，取？0?反应产物2(^1^，在100￥电压下，经1.5%琼脂糖凝胶（含6611^(1)电泳3〇1^11， GeneGenius凝胶分析系统检测照相，即可完成竹节参的序列特异性扩增区域（SCAR)标记 分子的鉴定。
[0024] 有益效果：
[0025] SCAR分子标记是针对RAH)特异性片段序列进行引物设计，再从基因组DNA中扩 增出该特异性片段的新技术。本文在RAro基础上成功建立鉴别竹节参及其它人参植物的 SCAR分子标记技术，只需依赖于SCAR特异性引物和PCR实验技术，就能够实现对竹节参及 其它人参植物的快速鉴别。SCAR标记操作简单快速，成本低廉，在不同实验室均易实现。
【附图说明】
[0026] 图1为人参、西洋参、三七的DNA经1. 0%琼脂糖凝胶的电泳结果，其中，1.人参， 2.西洋参，3.三七。
[0027] 图2为竹节参DNA经1.0%琼脂糖凝胶的电泳结果，其中，1.竹节参。
[0028] 图3为H03引物扩增产物电泳图，其中，