] 结果如图2C和图2D所示：在白天结束时，定性检测结果表明，沉默APS1的烟草植 株（VIGS-APS1)叶片内几乎无可见淀粉，定量检测结果表明，其淀粉含量仅为野生型烟草 植株叶片含量的35. 8%，说明APS1的沉默的确能够减少叶片淀粉的合成；在各个时间点， 共同沉默APS1和TUB8的烟草植株（VIGS-APS1+TUB8)的淀粉量均稍低于沉默TUB8的烟草 植株的叶片淀粉含量；而在夜晚结束时，相对于对照植株（VIGS-Vector)，共同沉默APS1和 TUB8的烟草植株（VIGS-APS1+TUB8)的叶片内仍有大量的淀粉留存。该实验进一步证实了 沉默TUB8的烟草植株叶片内的淀粉积累表型不是淀粉合成加快造成，而是叶片淀粉的降 解受阻过程阻滞所导致的。
[0135] 已有的研究成果表明，叶片淀粉的降解通过两种途径进行：一种是经典的质体内 降解途径，这也是最主要的降解的降解途径；另一条是细胞自噬的降解途径。结合TUB8沉 默叶片及细胞自噬关键基因ATG6沉默叶片中的淀粉积累量的比较显示（图2A)，TUB8沉默 叶片中的淀粉积累量要远远高于ATG6沉默叶片中的淀粉积累量。这表明叶片淀粉的细胞 自噬降解途径受阻不是造成TUB8沉默叶片呈现严重淀粉积累表型的唯一原因；叶片淀粉 经典的质体内降解途径的受阻也是造成TUB8沉默叶片淀粉积累的原因。
[0136] 综上所述，微管网络的正常存在对于淀粉通过两条代谢途径（细胞自噬降解途径 和经典的质体内降解途径）进行降解代谢是必需的，可以通过抑制微管网络的聚合来提高 植物叶片淀粉的含量，获得高淀粉含量植物。
[0137] 实施例2、微管解聚剂在提高植物叶片淀粉含量中的应用
[0138] 本发明通过在烟草中施用微管解聚剂：甲基胺草膦（Amiprophos-methyl，简称 APM，购自Sigma-Aldrich)和氨璜乐灵（Oryzalin，购自Sigma-Aldrich)，实现植物叶片中 淀粉含量的增加。微管解聚剂的施用方法如下：
[0139] -、平板萌发法施用微管解聚剂
[0140] 1、平板萌发法施用微管解聚剂
[0141] 平板萌发法施用微管解聚剂的操作步骤如下：将烟草种子（Nicotiana benthamiana)进行表面消毒（用10%次氯酸钠溶液浸泡15分钟，之后用灭菌双蒸水洗涤 5次，每次2分钟）；表面消毒后的种子分别点铺到含有10μΜAPM的MS培养基平板、含 有10μΜOryzalin的MS培养基平板和不含有任何药剂的MS培养基平板上，置于光周期 是16小时光照/8小时黑暗的培养室中光照培养，分别得到10μΜAPM处理的小苗、10μΜ Oryzalin处理的小苗和野生型小苗（Control);收取2-3周大的10μΜAPM处理的小苗、 10μMOryzalin处理的小苗和野生型小苗用于淀粉含量分析。
[0142] 2、实验结果
[0143] (1)表型的观察
[0144] 对10μΜAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗和野生型小苗（Control) 的表型进行观察。
[0145] 结果如图3A所示：和野生型小苗（Control)相比，10μΜAPM处理的小苗和10μΜ Oryzalin处理的小苗的生长发育均明显受阻。具体表现在：MS平板上生长三周左右的野 生型小苗（Control)具有4-7片叶、15-20mm左右的株高，根系发育正常；而在含有10μΜ APM的MS平板和含有10μMOryzalin的MS平板上生长的10μΜAPM处理的小苗和10μΜ Oryzalin处理的小苗仅能长出两片子叶，之后胚轴和子叶的生长就几乎停滞，且无明显根 结构。说明微管解聚剂的处理会抑制烟草的生长发育。
[0146] (2)淀粉含量的检测
[0147] 对10μΜ APM处理的小苗、10μM Oryzalin处理的小苗和野生型烟草小苗 (Contro 1)体内的淀粉含量进行定性和定量检测。
[0148] 淀粉含量的定性检测结果如图3B所示，淀粉含量的定量检测结果如图3C所示。定 性和定量检测结果均表明在含有10μΜAPM的MS平板和含有10μMOryzalin的MS平板 上生长的10μΜAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗的淀粉含量均显著高于野生 型小苗（Control)体内的淀粉含量。
[0149] 二、植物移植法施用微管解聚剂
[0150] 1、植物移植法施用微管解聚剂
[0151] 植物移植法施用微管解聚剂的操作步骤如下：将烟草种子进行表面消毒（用10% 次氯酸钠溶液浸泡15分钟，之后用灭菌双蒸水洗涤5次，每次2分钟）；表面消毒后的种子 播至含MS培养基的组培瓶中进行培养，光周期是16小时光照/8小时黑暗；生长2-3周后， 得到烟草苗，将烟草苗分别移至含10μΜΑΡΜ、50μΜΑΡΜ、10μΜ0ryzalin、50yMOryzalin 及不含任何药剂的组培瓶中进行处理。药剂施用4周后，分别得到10μMAPM处理的小苗、 50μΜAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗、50μMOryzalin处理的小苗及野生型 小苗（Control)进行淀粉含量分析。
[0152] 2、淀粉含量的检测
[0153] (1)表型的观察
[0154] 对10μΜAPM处理的小苗、50μΜAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗、 50μMOryzalin处理的小苗及野生型小苗（Control)的表型进行观察。
[0155] 结果如图3E所示：从图中可以看出，10μΜAPM处理的小苗、50μΜAPM处理的小 苗、10μMOryzalin处理的小苗、50μMOryzalin处理的小苗的生长明显滞后于野生型小 苗。其中，APM对烟草生长的抑制作用较Oryzalin明显，10μΜAPM处理的小苗、50μΜAPM 处理的小苗都变现出顶端生长停滞、叶片黄化的表型。Oryzalin处理的小苗的生长受抑制 程度与浓度有关，50μΜOryzalin处理的小苗生长的抑制作用明显强于10μΜOryzalin， 且叶片黄化表型仅出现在高浓度处理组中。
[0156] (2)淀粉含量的检测
[0157] 对10μΜAPM处理的小苗、50μΜAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗、 50μΜOryzalin处理的小苗及野生型小苗（Control)的淀粉含量进行定性和定量检测。
[0158] 淀粉含量的定性检测结果如图3F所示，从图中可以看出：APM和Oryzalin的各个 浓度处理组均能使受处理的烟草植株叶片出现淀粉积累，而且施加药剂浓度越高的烟草叶 片中的淀粉积累量越高。
[0159] 淀粉含量的定量检测结果如图3D所示，从图中可以看出：和野生型小苗 (Control)相比，ΙΟμΜAPM处理的小苗和ΙΟμΜOryzalin处理的小苗的淀粉含量明显增 加，ΙΟμΜAPM或ΙΟμΜOryzalin的处理就能明显的提升烟草叶片中的淀粉含量。
[0160] 综上所述，可以通过用微管解聚剂来抑制微管网络的聚合，从而来提高植物叶片 淀粉的含量，获得高淀粉含量植物。
【主权项】
1. 抑制植物微管聚合的物质在如下（1)-⑷中至少一种中的应用： (1) 提高植物叶片中的淀粉含量； (2) 抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径； (3) 抑制植物叶片淀粉的质体内降解途径； (4) 培育高淀粉含量的植物。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径体现在植物叶片中自噬结构的减少。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制植物微管聚合的物质为如下1) 或2): 1) 抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质； 2) 微管解聚剂。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质 为如下A)或B): A) 序列表中序列1所示的DNA分子； B) 含有所述A)的表达载体； 所述B)具体为将所述A)插入表达载体得到的重组载体； 所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵。5. -种具有如下1)_5)中至少一种功能的产品，其活性成分为抑制植物微管聚合的物 质； 1) 提高植物叶片中的淀粉含量； 2) 抑制植物微管的聚合； 3) 抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径； 4) 抑制植物叶片淀粉的质体内降解途径； 5) 培育高淀粉含量的植物。6. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解 途径体现在植物叶片中自噬结构的减少。7. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述抑制植物微管聚合的物质为如下1) 或2): 1) 抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质； 2) 微管解聚剂。8. 根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质 为如下A)或B): A) 序列表中序列1所示的DNA分子； B) 含有所述A)的表达载体； 所述B)具体为将所示A)插入表达载体得到的重组载体； 所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵。9. 一种培育高淀粉含量的植物的方法，如下1)或2): 1)包括如下步骤：将抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质导入植物中，得到高淀粉含量 的植物； 2)包括如下步骤：在含有微管解聚剂的培养基中培养植物，得到高淀粉含量的植物。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物 质为如下A)或B): A) 序列表中序列1所示的DNA分子； B) 含有所述A)的表达载体； 所述B)具体为将所示A)插入表达载体得到的重组载体； 所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵； 所述微管解聚剂在所述培养基中的浓度为10-50μM。
【专利摘要】本发明提供了一种提高植物叶片淀粉含量的方法。本发明提供的提高植物叶片淀粉含量的方法包括将抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质导入受体植物中，得到淀粉含量提高的转基因植物或在含有微管解聚剂的培养基中培养植物，实现植物叶片中淀粉含量的提高。通过实验证明：本发明提供的下调微管蛋白基因表达或施用微管解聚剂的方法简单、方便、可重复性好，能够很有效增加植物叶片淀粉的含量，有利于推动农业生产中高淀粉含量的材料的获得以及该些材料在生物能源制造等其他重要产业上的应用，为通过干扰微管实现植物绿色组织淀粉含量的提升提供了重要的理论支持。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/84, C12N15/113
【公开号】CN105349577
【申请号】CN201510535798
【发明人】刘玉乐, 王燕, 郑翕尹, 余冰洁
【申请人】清华大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年8月27日