一种荔枝霜疫霉菌分子检测引物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明一种荔枝霜疫霉菌分子检测引物及其检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间荔枝霜疫霉病早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。
【背景技术】
[0002]荔枝味佳、色美、营养丰富，是热带和亚热带地区水果，分布遍及海南、福建、广西、广东、台湾等省，具有重要经济价值。由蒸枝霜疫霉菌WicAii)引起的荔枝霜疫霉病是荔枝最重要病害之一，严重影响荔枝产量、品质以及鲜果贮运和外销。该病最早在我国的台湾省发现，目前在福建、广东、广西、海南、云南、贵州、四川、台湾等地均有发生，不仅严重为害接近成熟的果实，也为害嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果，引起大量落果和烂果，产量损失高达80%以上，甚至绝收，造成巨大经济损失。近几年该病流行频率和流行程度有逐渐加重的趋势，已成为荔枝生产上的一个重要障碍。鉴于荔枝霜疫霉病的巨大破坏性，为防止该病扩散蔓延，建立快速有效的检测方法十分必要。
[0003]目前对荔枝霜疫霉病的检测大多仍沿用传统培养和血清学鉴定方法。传统的病原菌检测技术是在分离培养获得相应病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成，而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，因此以病原菌形态学特征为判断基础的传统病原菌诊断方法，因其耗时长，效率低，难以满足对荔枝霜疫霉病诊断的实际需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期。免疫血清学鉴定方法虽已建立，但血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，容易造成假阳性，这些方法的应用均受到一定的限制。
[0004]近年来随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术的应用在很大程度上弥补了传统方法的不足。这类方法普遍具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点，在控制植物病害的传播、成灾中已经开始发挥重要作用。国内外学者利用基于ITS碱基序列设计引物对卵菌的分子检测开展研究，但是以ITS为靶序列设计引物存在难以区分近似种的问题。已有研究表明，三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Jptl)是一个与原癌基因Ras (Ratsarcoma)相关的基因，在酵母中同，该基因编码一个与Ras相关GTP结合蛋白。基因含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些内显子在不同种之间具有多变性，其保守序列和进化区域相互间隔，非常适合作为霜疫霉菌分子检测的靶标。因此，本研究分析了荔枝霜疫霉菌与其它30种卵菌在办Η基因序列上的差异，设计了特异性引物，并在此基础上建立了荔枝霜疫霉菌的PCR快速分子检测体系。此技术可应用于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供科学依据。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中荔枝霜疫霉菌传统检测方法对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，且十分耗时，无法达到快速检验的问题，提供荔枝霜疫霉菌的特异分子检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的荔枝霜疫霉菌的快速分子检测体系和程序。该方法可用于带菌植株的高灵敏度快速分子检测，此技术对于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。
[0006]实现本发明的目的包括下列步骤:
1.根据荔枝霜疫霉菌7/^7基因序列的保守区和进化区相互间隔的特点，分别设计了对荔枝霜疫霉菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，序列如下:
PvYFl:5’ -GTCCGAGTTTCTAGCAGATTG-3’ ；
PvYRl:5’ -ACGATAATACCGTGAGCGCC-3’。
[0007]2.荔枝霜疫霉菌快速检测体系的建立
(1)从荔枝霜疫霉菌、被荔枝霜疫霉菌感染的植株中提取DNA;
(2)荔枝霜疫霉菌特异PCR快速检测体系的建立
所述 PCR 反应体系 25.0 μ 1，包括 2X 71 即 PCR Master Mixl2.5 yL，10 ymol/L 的引物(PvYFl/PvYRl)各0.5 μ L，DNA模板25ng，不足部分由dd H20补足。PCR反应条件为:95°C预变性 3min ;94°C变性 lmin，59°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 28 个循环；72 °(:延伸 10 min。
[0008](3)荔枝霜疫霉菌巢式PCR快速检测体系的建立
以疫霉菌通用引物(YphlF/Yph2R)进行第一轮PCR扩增，反应体系25.0 yL，包括2X Taq PCR Master Mixl2.5 μ L, 10 μ mol/L 的引物(YphlF/Yph2R)各 1.0 μ L，DNA模板25ng，不足部分由dd H20补足。PCR反应条件为:95°C预变性3min，94°C变性lmin，55°C退火30 sec，72°C延伸lmin，共30个循环，72 °C延伸10 min。
[0009]分别取1 μ L第一轮PCR产物做为DNA模板，用引物(PvYFl/PvYRl)进行第二轮PCR 扩增。反应体系 25.0 μ 1，包括 2X 71 即 PCR Master Mixl2.5 yL，10 μ mol/L 的引物(PvYFl/PvYRl)各0.5 yL，DNA模板1 μ L，不足部分由dd H20补足。PCR反应条件为:95°C预变性3min ;94°C变性lmin，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共28个循环；72 °C延伸10min0
[0010]然后取PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出249bp的产物，即可判断所述的植株样品中存在荔枝霜疫霉菌。
[0011]本发明的关键性技术是荔枝霜疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了检测荔枝霜疫霉菌特异引物准确性，本发明以我国福建、广东、广西、台湾等省的21株荔枝霜疫霉菌和其它13种不同卵菌及9种真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下:取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μ12% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2% CTAB ；100 m mol/L Tris-HCl, pH 8.0;20mmol/L EDTA, pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和 90μ1 10% SDS (十二烷基苯磺酸钠)后振荡混勾，于55?60°C水浴1.5 h,每10 min颠倒混勾一次，水浴1.5h后离心(12, OOOrpm)8min，取上清液加入等体积的酸/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒使充分混勾，离心(12，OOOrpm) 12 min，取上清液(水相)，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒使充分混匀，离心(12，OOOrpm )5min，吸上清，加0.1体积的3mol/L NaAC溶液和2体积的冰无水乙醇，置-20 °C冰箱中沉淀30 min以上，12，OOOrpm离心5 min，轻轻地倒去上清液，加入700μ1冰70%乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1ΧΤΕ(10mmol/LTris-HCl, 0.lmmol/LEDTA, pH8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/ μ L待用。
[0012]经对供试菌株和21株荔枝霜疫霉菌的特异性进行PCR验证。PCR反应体系25.0 yL，包括 2X 71 即 PCR Master Mixl2.5 μ L, 10 μ mol/L 的引物(PvYFl/PvYRl)各 0.5yL，25ng DNA模板，不足部分由dd H20补足。PCR反应条件为:95°C预变性3min ;94°C变性lmin，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共28个循环；72 °C延伸10 min。此特异引物在蒸枝霜疫霉菌中特异性地扩增出249bp的产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植株中荔枝霜疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。
[0013]当用于植株中存在荔枝霜疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉菌的DNA，具体过程如下:(1)将荔枝病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按lmg病叶加入10uL (0.5mol/L NaOH, 0.5%PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，在12，000g离心机中离心5min ； (3)取上清20uL与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl (pH8.0)混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1 μ?原液、10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板，按如下的PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增。PCR反应体系25.0 μ L，包括2 X Taq PCR MasterMixl2.5yL, 10 μ mol/L 的引物(PvYFl/PvYRl)各 0.5 μ L，DNA 模板 1 μ?，不足部分由dd H20补足。PCR反应条件为:95°C预变性3min ;94°C变性lmin, 59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共28个循环；72 °C延伸10