制备细胞培养用活性成分组合物的方法及细胞培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞培养领域，具体涉及细胞培养用的活性成分组合物以及相关培养基的制备和使用。
【背景技术】
[0002]干细胞是一类特殊的细胞，其具有自我复制能力，并且在特定条件下，可以分化成多种功能细胞。依据不同的分类方法，干细胞可分为胚胎干细胞、成体干细胞，或者全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞等。干细胞在受损组织器官的修复与再生、高效医药活性成分制备等方面具有诱人前景。以干细胞培养技术为基础的研发在近几年急剧增加，成为新的医药和健康领域的研究热点。
[0003]培养细胞的完全培养基由基础培养基(如MEM和DMEM等)和添加剂(如血清或无血清培养用的激素及生长因子)组成。因此，按照是否含有血清，可将细胞培养基分成两类，即含有血清的培养基和无血清培养基。血清含有生长因子可促进细胞的繁殖，含有附着因子可促进细胞的贴壁，同时还具有抗胰酶活性。血清同时也是矿物质、脂类及激素的来源。然而，含有血清的培养基的一个主要缺陷是有动物来源成分，有些成分还没有完全研究清楚，在与药物研究有关的实验中，动物来源成分可能会带来生物安全的问题，从这个角度来说，在细胞培养时血清含量越少越好。
[0004]无血清培养基一般由营养成分和和生物活性分子组成，一般需要添加十几种到几十种活性分子，各活性分子之间的相对数量比例关系难以调整到最佳状态，从而难以发挥细胞的最优生长性能。
[0005]在干细胞培养过程中，细胞培养基是干细胞生长分化的关键因素。由于干细胞的特殊性，对培养基的要求尤其高。现有干细胞无血清培养基是由营养型添加物与活性分子组成，但是各活性分子的比例难以准确把握，在培养干细胞特别是早期干细胞时难以发挥细胞的最大生长能力。另外在由干细胞培养物治疗某些疾病的时候，特别是当疾病涉及到多种生物活性分子时，传统的干细胞培养基制备的培养物难以奏效。
[0006]如中国专利申请CN103805562B公开的一种培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基，以DMEM培养液为基础，还含有成纤维细胞生长因子受体2、生长激素、胰岛素、转铁蛋白、谷胱甘肽、BMP-4、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸以及β -巯基乙醇等。
[0007]又如中国专利申请CN104877962A公开的一种无血清的脂肪干细胞培养基，包括HffiM基础培养基，还包括如下组分:重组人胰岛素、重组转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、纤维连接蛋白、胎球蛋白、茶多酚和干细胞生长因子。
[0008]综上所述，本领域仍然需要适合用于细胞培养尤其是干细胞培养的活性成分及培养基。
【发明内容】
[0009]为解决上述技术问题，本发明提供一种能够满足细胞生长需求的新型的细胞培养用活性成分组合物及其制备方法以及包含该活性成分组合物的培养基及其用途。
[0010]本发明的活性成分组合物及含有该组合物的细胞培养基克服了现有的含血清培养基和无血清培养基的缺点。如上文【背景技术】中所述，现有的细胞培养基分为两种，含有或不含血清。含有血清的培养基的主要缺陷是有动物来源成分，在与药物研究有关的实验中，动物来源成分可能会带来生物安全的问题。另一方面，无血清培养基一般由营养型添加物和十几种到几十种活性分子组成，各活性分子的比例难以准确把握，从而难以发挥细胞的最大生长能力。
[0011]根据本发明的第一方面，提供一种制备细胞培养用活性成分组合物的方法，包括以下步骤:1)培养第一种细胞，细胞为哺乳动物脂肪干细胞，培养至融合率80%以上，除去细胞，获得第一种细胞上清液；2)培养第二种细胞，细胞为哺乳动物成纤维细胞，培养至融合率80%以上，除去细胞，获得第二种细胞上清液；以及3)将以上两种上清液混合，从而制成细胞培养用活性成分组合物。
[0012]—个优选实施方式中，第一种细胞上清液与第二种细胞上清液的体积比为
1:0.2 ?5ο
[0013]另一个优选实施方式中，该方法还包括培养第三种细胞的步骤，第三种细胞与待用细胞培养用活性成分组合物培养的细胞来自于同一物种，培养至融合率85%以上，除去细胞，获得第三种细胞上清液，并将获得的三种上清液混合，从而制成细胞培养用活性成分组合物。
[0014]更优选地，第一种细胞上清液与第二种细胞上清液的体积比为1:0.2?5，第一种细胞上清液与第三种细胞上清液的体积比为1:0.2?5。
[0015]可选择地，第一种细胞、第二种细胞和第三种细胞分别来自于同一种哺乳动物，比如人类、猿类或鼠类。
[0016]可选择地，第一种细胞、第二种细胞和第三种细胞可以分别来自于不同的哺乳动物，比如:第一种细胞和第二种细胞来自于人类，第三种细胞来自于鼠类。
[0017]另一个优选实施方式中，还包括向上清液混合液中添加至少一种选自以下的活性成分的步骤:胰岛素、胎球蛋白、亚油酸、转铁蛋白、地塞米松、成纤维细胞生长因子或亚砸酸钠。
[0018]优选地，分别向上清液混合液中加入胰岛素、胎球蛋白、亚油酸、转铁蛋白、地塞米松、成纤维细胞生长因子、亚砸酸钠，使以上成分的终浓度分别为0.2-17.2ng/L、0.2?0.8mg/mL、0.5 ?2 μ g/mL、30 ?70 μ g/mL、0.025-2.54ng/L、80 ?150ng/mL、0.12-0.29ng/L0
[0019]本发明第二方面提供用本发明上述方法制备的细胞培养用活性成分组合物。
[0020]本发明第三方面提供一种细胞培养基，包括细胞基础营养培养基和本发明的活性成分组合物。
[0021]优选地，细胞培养用活性成分组合物与细胞基础营养培养基的体积比为1:5?
20 ο
[0022]其中，细胞基础营养培养基包括但不限于DMEM或MEM培养基。
[0023]本发明第四方面提供一种细胞培养方法，所述方法包括使用本发明的活性成分组合物或本发明的细胞培养基的步骤。一个优选实施方式中，待培养的细胞是干细胞，优选脂肪干细胞或骨髓间充质干细胞。
[0024]本发明第五方面提供本发明的活性成分组合物或本发明的细胞培养基在细胞培养中的用途。一个优选实施方式中，待培养的细胞是干细胞，优选脂肪干细胞或骨髓间充质干细胞。
[0025]本发明的有益效果是:与现有技术的培养基相比，本发明的活性成分组合物包含特定的细胞培养上清液，含有本发明活性成分组合物的细胞培养基不含血清(即不含其他动物来源成分)，而且添加较少的其他活性分子。本发明的活性成分组合物中已含有细胞生长所需要的多种活性成分，而且这些活性成分相互之间的比例是天然状态下的比例，符合细胞生长的自然需求，因而可以保证细胞的最佳生长。此外，当需要用干细胞治疗的疾病涉及多种生物活性分子而传统的干细胞培养基制备的培养物难以奏效时，利用本发明的培养基培养的干细胞培养物可以达到较好的治疗效果。
【具体实施方式】
[0026]下面通过参考【具体实施方式】对本发明作出进一步地详细阐述，但这些阐述并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，否则本文所用的所有科学和技术术语具有本发明所属和相关技术领域的一般技术人员通常理解的含义。
[0027]本发明提供一种制备细胞培养用活性成分组合物的方法，所述方法包括以下步骤:1)培养第一种细胞，所述细胞为哺乳动物脂肪干细胞，培养至融合率80%以上，除去细胞，获得第一种细胞上清液；2)培养第二种细胞，所述细胞为哺乳动物成纤维细胞，培养至融合率80%以上，除去细胞，获得第二种细胞上清液；以及3)将以上两种上清液混合，从而制成所述细胞培养用活性成分组合物。
[0028]—个优选实施方式中，所述第一种细胞上清液:第二种细胞上清液的体积比为10:1到1:10，优选5:1到1:5，最优选1:1。另一优选实施方式中，融合率为80% -97%，优选85% -95%。可采用过滤或者其他本领域技术人员所知的方式从细胞培养液中除去细胞以获得上清液。上述方法中的步骤1)和步骤2)不分先后顺序。
[0029]另一个优选实施方式中，上述方法除包括培养第一种和第二种细胞之外，还任选包括培养第三种细胞，尤其是当预期用本发明的细胞培养基培养的细胞与所述第一种和/或第二种细胞不来源于同一物种时，优选培养第三种细胞，该第三种细胞与预期用本发明的细胞培养基培养的细胞来自于同一物种。例如，如果制备用于鼠胚胎纤维原细胞的培养基，则选择大鼠肝细胞或