一种鸡新城疫病毒稀释液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体设及一种鸡新城疫病毒稀释液及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 新城疫（Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus, NDV)引起的一种烈性病毒性传染病，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，也是我 国所有鸡病中危害最大的一种，被国际兽疫局（0IE)列为A类传染病。
[0003] 目前病毒的培养有动物接种、组织培养和鸡胚培养3种方法。其中鸡胚培养是病 毒培养中最常用的方法之一。鸡胚是正在发育中的机体，多种动物病毒能在鸡胚中增殖和 传代。鸡胚的优点在于胚胎的组织分化程度低，而且可W选择不同的日龄和接种途径，病毒 在鸡胚中易于增殖，部分病毒感染鸡胚W后可W产生豆瓣，引起充血、出血、坏死灶和死亡 等特异性的感染指征。感染病毒的鸡胚组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且 来源充足，设备和操作简便易行。
[0004] 当前国内生产的新城疫疫苗基本都是采用鸡胚接种病毒后进行增殖，收获尿囊液 制备而成。研究表明，鸡胚日龄和种毒接种量与收获时的鸡胚尿囊液量呈负相关。即随着 接种鸡胚日龄的增加和种毒接种量的提高，收获的鸡胚尿囊液会减少。通常选用10日龄 鸡胚进行新城疫病毒接种培养繁殖，一般在培养96~120小时收获鸡胚液，即14~15日 龄，此时日龄偏大，尿囊液含量不高(鸡胚发育的13~14日龄尿囊液含量最高）;若提高尿 囊液含量必须提前收获，但此时病毒含量并未达到峰值，造成毒价降低同样得不偿失。另外 日龄越低鸡胚的组织分化程度越低，越有利于病毒的增殖，但按通常手段采用低日龄巧曰9 日龄）鸡胚进行病毒的接种培养，因鸡胚抵抗力差，过早死亡等导致鸡胚尿囊液中病毒毒价 较低，尿囊液含量也较低。
【发明内容】
阳0化]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鸡新城疫病毒稀释液 及其制备方法的技术领域。
[0006] 所述的一种鸡新城疫病毒稀释液，其特征在于所述的鸡新城疫病毒稀释液每 1000ml憐酸缓冲液中含有W下重量配比的组分：氨基酸组合6~lOg、维生素组合1~5g、 亚砸酸钢12~18mg和复方中药多糖5~20g，所述的氨基酸组合包括苯丙氨酸、脫氨酸和 亮氨酸，所述的维生素组合包括维生素B2、维生素D和维生素E，所述的复方中药多糖由赤 巧、丹参、白薇、商陆和虫草提取得到。
[0007] 所述的一种鸡新城疫病毒稀释液，其特征在于稀释液的抑为6. 6~7。
[0008] 所述的一种鸡新城疫病毒稀释液，其特征在于所述的憐酸缓冲液由氯化钢6~ 1〇邑，氯化钟0. 05~0. 5g，憐酸氨二钢1~1. 2g，憐酸二氨钟0. 05~0. 5g，氯化巧0. 05~ 0. 2g，含6个结晶水的氯化儀0. 05~0. 2g溶于1000ml双蒸水中得到。
[0009] 所述的一种鸡新城疫病毒稀释液，其特征在于所述的每1000ml憐酸缓冲液中含 有W下重量配比的组分：氨基酸组合8~lOg、维生素组合2~3g、亚砸酸钢14~16mg和 复方中药多糖10~15邑。
[0010] 所述的一种鸡新城疫病毒稀释液，其特征在于所述的氨基酸组合含有W下重量百 分比含量的氨基酸：苯丙氨酸10~50%、脫氨酸20~40%和亮氨酸30~60%，优选为苯丙 氨酸20~35%、脫氨酸25~35%和亮氨酸40~50〇/〇。
[0011] 所述的一种鸡新城疫病毒稀释液，其特征在于所述的维生素组合含有W下重量百 分比含量的维生素：维生素B2 15~40%、维生素D20~50%和维生素E20~40%，优选为 维生素B2 20~35%、维生素D30~45%和维生素E30~35〇/〇。
[0012] 所述的一种鸡新城疫病毒稀释液，其特征在于所述的复方中药多糖按W下步骤制 得： a、 按赤巧20~40份、丹参5~20份、白薇10~30份、商陆5~20份和虫草10~30 份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至 90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上 清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； t用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉 淀，收集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉。
[0013] 所述的一种鸡新城疫病毒稀释液制备方法，其特征在于包括W下工艺步骤： 1) 憐酸缓冲溶液的配制：按比例称取氯化钢、氯化钟、憐酸氨二钢、憐酸二氨钟、氯化 巧、含6个结晶水的氯化儀溶于双蒸水中，无菌条件下通过0. 22μm滤膜，过滤除菌备用； 2) 复方中药多糖的制备 a、 按比例称取赤巧、丹参、白薇、商陆和虫草，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原 料重量15倍的纯化水，水浴至9(TC，并保持在9(TC，熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽 拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上 清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； t用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉 淀，收集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉； 3) 接种鸡胚用病毒稀释液配制：按比例称取葡萄糖、氨基酸组合、维生素组合、复方中 药多糖和亚砸酸钢，溶解于步骤1)制得的憐酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节抑至 6. 6~7.ο之间，无菌条件下通过0. 22μm滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用。
[0014] 本发明的有益效果是： (1)本发明所制备的稀释液，在接种鸡胚时能够同时提供给鸡胚必需的营养，可解决鸡 胚低日龄培养难题。
[0015] (2)本发明所制备的稀释液，可接种低日龄鸡胚，因低日龄鸡胚组织分化程度较 低，与现有技术相比，病毒更易在鸡胚组织中增殖。
[0016] (3)本发明所制备的稀释液接种鸡胚后，可提高鸡胚耐受病毒的能力，延长死亡时 间，即延长了病毒增殖时间，与现有技术相比提高了病毒滴度8倍W上。
[0017] (4)本发明所制备的稀释液，接种低日龄鸡胚，意外的发现所收获的尿囊液体积大 幅增加，与现有技术相比，所获得的尿囊液体积提高了40~50%。
【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 运些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019] 实施例1 一种鸡新城疫病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml憐酸缓冲液中含有：氨基酸组合8g(其中苯丙氨酸3. 2g、脫氨酸2. 4g、亮氨酸2. 4g)、维生素组合3g(其中维生素B2 0. 9g、维 生素D0.9g、维生素E1.2g)、复方中药多糖15g、亚砸酸钢16mg，该稀释液抑为6.8。
[0020] 一种鸡新城疫病毒稀释液的制备方法，其步骤是： (1)憐酸缓冲溶液的配制：按上述憐酸盐缓冲液配方准确称取氯化钢8g，氯化钟0. 2g， 憐酸氨二钢1. 15g，憐酸二氨钟0. 2g，氯化巧0.Ig，含6个结晶水的氯化儀0.Ig溶于1000ml 双蒸水中，无菌条件下通过0. 22μm滤膜，过滤除菌备用。
[0021] (2)复方中药多糖的制备 a、按赤巧30份、丹参15份、白薇20份、商陆10份和虫草20份称取所述中药原料，切 碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C， 熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽拌一次。
[0022]b、弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集 上清。
[0023] C、采用公知的醇沉法，将b中上清进行醇沉，沉淀为粗制中药多糖。
[0024]t用灭菌纯化水洗涂C中粗制多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉 淀，收集上清。
[00巧]e、采用公知的真空减压浓缩法，将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩 液。 阳0%] f、采用公知的真空冷冻干燥法，将e中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合 中药多糖冻干粉。
[0027] (3)接种鸡胚用病毒稀释液配制：按上述优选稀释液组分数准确称取苯丙氨酸 3. 2g、脫氨酸2. 4g、亮氨酸2. 4g、维生素B2 0. 9g、维生素D0. 9g、维生素E1.2g、复方中药 多糖15g、亚砸酸钢16mg，按比例溶解于步骤（1)中的1000ml憐酸缓冲溶液中，充分混匀， 用酸或碱调节pH至6. 8,无菌条件下通过0. 22μm滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用。 阳0測 实施例2 一种鸡新城疫病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml憐酸缓冲液(该憐酸缓冲液由氯化 钢6g，氯化钟0. 05g，憐酸氨二钢Ig，憐酸二氨钟0. 05g，氯化巧0. 05g，含6个结晶水的氯 化儀0. 05g溶于1000ml双蒸水中得到)中含有：氨基酸组合6g(其中苯丙氨酸3g、脫氨酸 1.2g、亮氨酸1.8g)、维生素组合5g(其中维生素B2 2g、维生素DIg、维生素E2g)、复方中 药多糖20g(从赤巧20份、丹