一种高纯度心肌细胞原代培养方法
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种高纯度心肌细胞原代培养方法，适用于在细胞水平进行相关心血管疾病研究，从细胞分子水平阐明机制问题，属于生物技术及医学领域。
【背景技术】
[0002]随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视。乳鼠心肌细胞体外培养可保留机体原有的一些结构和功能上的特点，具有搏动性，并且不受神经、体液等因素的干扰，可进行心肌细胞生长发育，病理生理、以及药理等多方面的实验研究，因此乳鼠心肌细胞的原代培养在心血管疾病的防治研究领域中应用广泛。
[0003]然而由于乳鼠心肌细胞原代培养方法种类繁多，并且心肌细胞在原代培养过程中容易受到损伤，造成存活率低。并且，心脏约80%由心肌细胞组成，另外约20%主要由成纤维细胞等非心肌细胞组成，而心肌细胞不易贴壁，成纤维细胞能快速贴壁，因此，在心肌细胞的原代培养过程中，容易形成成纤维细胞生长优势，从而导致心肌细胞纯度不高等缺陷。如何获得大量具有正常生理功能的心肌细胞，提高细胞的纯度是心肌细胞培养中的关键问题。
[0004]心肌细胞原代培养主要有3种方法:离体心脏灌注法，组织块法和酶消化法。离体心脏灌注法对乳鼠来说，操作难度较大。组织块法操作简单，能获得较高纯度的心肌细胞。酶消化法对酶的浓度以及酶作用的时间有严格的控制，但是能获得大量的单细胞。因此，心肌细胞的原代培养，多用组织块法和酶消化法。两种方法各有优缺点。
[0005]1.组织块法:
[0006]优点:(1)操作简单，不需要酶消化，只需将心脏剪成小块，在培养皿均匀铺满即可。(2)分离得到的心肌细胞结构完整，没有酶的消化作用，所以，得到的心肌细胞存活率高，形态结构完整。(3)不需要繁琐的实验步骤，对试剂耗材要求较低，经济节约。
[0007]缺点:获得的心肌细胞数量少，难以满足实验所需。如果需要大量心肌细胞，则需要进行多次分批分离，所需实验周期长，难以达到实验目的。
[0008]2.酶消化法是指采用胰蛋白酶和I1-型胶原酶混合消化心脏组织块，从而分离得到单个的心肌细胞。
[0009]优点:酶对组织块的消化可以获得大量单个分离的心肌细胞，可以满足对心肌细胞数量要求较高的实验。
[0010]缺点:对细胞损伤较大，由于酶对心肌细胞的作用，以及离心，重悬等步骤，会对分离的心肌细胞有不同程度的化学或物理损伤。并且，酶的浓度以及酶作用时间不同，对心肌细胞的损伤程度也不同。心脏组织中的成纤维细胞由于贴壁能力强，并且心肌细胞在酶液的消化作用下有不同程度的损伤，所以很容易形成成纤维细胞的生长优势，从而逐渐稀释心肌细胞，导致分离得到的心肌细胞纯度很低。
[0011]两种方法各有利弊，因此，想要在短时间内获得大量存活率高且纯度高的心肌细胞以满足实验要求是一个技术难题。
【发明内容】
[0012]本发明解决了现有技术中的不足，提供了一种能够快速分离得到大量纯度高、活力好的心肌细胞的原代培养方法。
[0013]实现本发明上述目的所采用的技术方案为:
[0014]—种高纯度心肌细胞原代培养方法，包括以下步骤:
[0015](1)、将离体的乳鼠心脏转入盛有DMEM/F12基础培养基的培养皿中，将心脏剪成组织碎片；
[0016](2)、将组织碎片转入EP管中，加入酶消化液，所述的酶消化液由I1-型胶原酶、胰蛋白酶以及PBS缓冲液组成，酶消化液中I1-型胶原酶的质量百分比浓度为0.04%，胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.09% ;
[0017](3)、将EP管置于35?40°C水浴条件中进行第一次消化，消化时间为6?10分钟，消化完毕后吸取上清液后并弃去；
[0018](4)、将EP管继续置于35?40°C水浴条件中，继续加入酶消化液进行后续消化，消化时间为10?12分钟，消化完毕后吸取上清液后并将上清液放置于离心管中，所述离心管中预先放置了含有胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，离心管置于冰上；
[0019](5)、重复步骤(4)，循环提取上清液，直至EP管中的组织碎片变白并变小后，完成上清液的收集，离心管中所收集的上清液即为心肌细胞悬液；
[0020](6)、将收集好的心肌细胞悬液离心并除去上清，再加入DMEM/F12完全培养基，进行心肌细胞重悬，制得心肌细胞重悬液；
[0021](7)、然后将心肌细胞接种在培养皿A中进行差时贴壁1?1.5h ;
[0022](8)、吸取培养皿A中的心肌细胞悬液到培养皿B中，清洗培养皿A中沉于皿底但未贴壁的心肌细胞并重悬，然后转入到培养皿B中进行培养。
[0023]步骤(3)中在第一次消化时摇晃EP管，并取出EP管弹2_10次，弹完后立刻水浴加热。
[0024]步骤(4)中在消化时摇晃EP管，每隔3min取出EP管并弹2_10次，弹完后立刻放入水浴加热。
[0025]步骤(6)中以lOOOrpm转速离心8min。
[0026]步骤(7)中进行差时贴壁前先将心肌细胞重悬液经细胞40 μ m滤网过滤，滤去细胞团块，用DMEM/F12完全培养基冲洗离心管和滤网。
[0027]步骤(8)中所述培养皿B在接种前用0.1 %明胶包被，并开启紫外灯照射30min。
[0028]步骤(8)的培养过程中，将每个培养皿B均按照前后左右方向摇晃以分散细胞。
[0029]在本领域中，胰蛋白酶可以使细胞间的蛋白质发生水解，从而使细胞分散，作用强烈，但是对细胞损伤较大。I1-型胶原酶的作用对象为胶原组织，仅对细胞间质有消化作用，能消化细胞间质中的胶原纤维从而释放细胞，作用温和，对细胞的伤害较小。为了减少对心肌细胞的损伤，同时不致消化作用太弱，通常将胰蛋白胰和I1-型胶原酶混合使用。乳鼠心肌细胞对酶消化极为敏感，因此，酶消化液的浓度以及消化时间在心肌细胞的原代培养中显得尤为重要。
[0030]胰蛋白酶的消化能力很强，常用浓度为0.05?0.5%，在37°C、pH 8.0条件下作用最强，易造成心肌细胞损伤，文献中有多种浓度胰蛋白酶消化的方法。胰蛋白酶浓度太低，尽管消化得到的心肌细胞活力较好，但是消化时间相应变长，而且得到的心肌细胞数量少，难以满足实验要求。胰蛋白酶浓度过高，则会损伤心肌细胞，造成心肌细胞贴壁率低，甚至不贴。
[0031]本发明在借鉴前人实验方法的基础上，经过多次实验摸索后，对酶消化液的浓度和配比进行了改进，采用较低浓度的胰蛋白酶，进行短时间多次重复消化，从而获得大量单个的心肌细胞，且心肌细胞活力高，心肌细胞心态轮廓清晰，可以看到较多细胞自发性搏动，免疫荧光染色显示原代培养的心肌细胞纯度很高。
【附图说明】
[0032]图1为本发明所培养的原代心肌细胞形态图；
[0033]图2为心肌细胞纯度鉴定染色图。
【具体实施方式】
[0034]为了使本发明要解决的技术难题更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。
[0035]本发明中所用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所用的仪器设备、试剂等，除非特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得。
[0036]小鼠鼠龄的选择:
[0037]选择乳鼠时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样分离得到的心肌细胞活力好，贴壁率高，所以最好选择新生1-3天的乳鼠。
[0038]实验试剂与消化酶液的使用:
[0039]1.胎牛血清:灭火后分装，每管50mL，贮存于_20°C。
[0040]2.0.1%明胶:去离子水