高产反式-4-羟脯氨酸sucA基因敲除菌的构建的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高产反式-4-羟脯氨酸菌株的构建，简单的说就是利用基因敲除和途 径取代的方法与理论来构建菌株，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 反式-4-轻脯氨酸（trans-4-Hydroxy-L-ProLine)，又名L-轻脯氨酸，是胶原蛋 白的主要组成成分。羟脯氨酸在很多领域具有重要的应用价值，如医药、食品、生化以及美 容行业等领域。如在医药方面，反式-4-羟脯氨酸是很多化学品合成的手性合成子，如消炎 药、碳青霉烯类、血管紧张肽转化酶抑制剂、抗高血压药物等，此外，由于其具有多种生理功 能和较为独特的生物活性，可作为治疗如风湿性关节炎、结缔组织受损等软组织疾病的药 物。在食品中的作用，如利用其呈苦味中的独特甜味的性质，可用于改善果汁的风味。在美 容业，作为化妆品添加剂，可起到抗氧化、抗辐射、保湿的作用，用于保养皮肤和延缓衰老。
[0003] 最初，羟脯氨酸是通过动物胶原蛋白的水解获得的，但该过程存在复杂、耗时、废 弃物过多的缺点。之后也有关于用微生物产羟脯氨酸的报导，但那些方法存在低产率、高成 本的问题，很难用于工业生产。故需要进一步改进生产菌株，优化生产工艺，降低生产成本， 提尚生广得率。
[0004] 本实验室已有的研究结果包括以下几个部分。根据密码子的简并性与大肠杆菌对 密码子的偏好性，优化反式-4-羟化酶基因（hyp)。通过改变同义密码子调整该基因的mRNA 的5'端，使其呈开放结构，以提高mRNA的翻译效率，使其能在大肠杆菌中得到更好的表达。 同时，选用组成型启动子一一色氨酸串联启动子（Ptrp2)来控制羟化酶基因的表达。该启 动子的特点就是不需要诱导剂的诱导，有利于羟脯氨酸后续的纯化。在实验室已有质粒的 基础上，优化表达载体，最终选用全细胞酶活最高的质粒--pUC19-Ptrp2-hyp作为最适表 达载体。之后，敲除基因 putA，以打断L-脯氨酸向L-谷氨酸的降解途径，使得更多的L-脯 氨酸进入反式-4-羟脯氨酸的生产途径。引入vgb基因，解决菌株生长过程中的溶氧过低 的问题，进一步提高发酵产量。
【发明内容】
[0005] 考虑到L-脯氨酸在生成反式-4-羟脯氨酸的过程中，有α -酮戊二酸、氧分子以 及亚铁离子（Fe2+)作为底物，产物中有琥珀酸、CO2。而α-酮戊二酸生成琥珀酸是TCA循 环过程中一个步骤，因此，考虑用L-脯氨酸的羟基化过程来取代TCA循环中的该过程，既保 证菌株的正常生长，又可以得到羟脯氨酸。
[0006] 本发明技术内容如下：
[0007] (1)构建含有打靶片段一一sucA上下游同源臂、羟化酶基因以及抗性筛选基因 Kan 的载体 pET21a_sucA' -Kan_hyp(pET21AKH)。
[0008] (2)在大肠杆菌BL21 (DE3) Δ putA的基础上，敲除sucA基因。
[0009] (3)转入质粒pUHVT4,之后进行发酵条件的优化与验证。
【附图说明】：
[0010] 图1实验思路与基本理论图。
[0011] 图2含有打靶片段的质粒PET21AKH的图谱。
[0012] 图3表达质粒pUHVT4图谱。
【具体实施方式】
[0013] (1)实验中涉及的主要试剂配制
[0014] LB培养基：lg/L胰蛋白胨，lg/L氯化钠，lg/L酵母提取物（Yeast Extract)。其 中固体培养基：加入1. 5% -2 %的琼脂粉。
[0015] 各种抗性平板：在（1)中的已灭菌的固体培养基的基础上，添加抗生素。配制浓度 为50mg/mL的抗生素母液，过滤除菌后-20°C保存。待灭菌后的固体培养基冷却至60°C左 右时，加入抗生素母液（稀释1000倍）。其中，氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素的终浓度均为 50 μ g/mL〇
[0016] 发酵培养基：葡萄糖8g/L，甘油10g/L，硫酸铵13g/L，玉米浆8g/L，磷酸氢二 钾I. 5g/L，氯化钠2g/L，氯化钙0. 015g/L，硫酸镁0. 3g/L，亚铁离子4mM，初始L-脯氨酸 IOOmM0
[0017] 柠檬酸缓冲液：50g柠檬酸，26. 3g NaOH，146. Ig结晶乙酸钠，溶于IL的水中，之后 加入200mL水和300mL的正丙醇，混匀。
[0018] 氯胺T试剂：1. 41g氯胺T，溶于IOml的水中，之后加入IOmL的正丙醇和80mL的 柠檬酸缓冲液，混匀。
[0019] 显色剂：5g对二甲基苯甲醛，溶于17. 5mL的高氯酸中，待溶解后缓缓加入32. 5mL 的异丙酮，混匀。
[0020] (2)相关的测量方法及比色法的原理
[0021] 羟脯氨酸含量的测定：将浓度为lg/L的羟脯氨酸标样稀释10倍，得到浓度为 l〇〇mg/L的反式-4-羟脯氨酸溶液，按照下表进行稀释：
[0023] 按照上述表格在试管中添加完毕后，向每支试管中加入ImL的氯胺T，反应20min 后，再加入ImL的显色剂，60°C水浴20min，冷却后用分光光度计测定560nm处的吸光值 (A5J。以吸光值（A 5J为横坐标，以L-羟脯氨酸终浓度为纵坐标，绘制反式-4-L-羟脯氨 酸的标准曲线。要测发酵液中的L-羟脯氨酸的浓度，需取ImL的发酵液，12000rpm离心 2min，估计发酵液中的L-羟脯氨酸的大致浓度，取适量的上清液，稀释合适的倍数，之后的 步骤与得到标准曲线的操作一致。
[0024] 比色法的原理：首先，羟脯氨酸与氯胺T反应，被氧化后生成含有吡咯环的物质， 然后加入含有高氯酸溶液和对二甲基苯甲醛的显色剂，其中的高氯酸可以除去剩余的氯胺 T，之后可以生成红色化合物，用紫外可见分光光度计在558±2nm处测定吸光值，通过与标 准样品的比较可以对羟脯氨酸进行定量。
[0025] 实施例1 :构建含有打靶片段的载体
[0026] 以大肠杆菌的基因组为模板，PCR得到sucA基因的上下游源臂；以质粒pKD4为模 板，PCR得到Kan抗性基因；之后将三者以摩尔比1:1:1的比例进行添加，做融合PCR，得到 含有sucA基因上下游同源臂以及Kan抗性基因的初步打靶片段（在设计引物时，上游同源 臂的5'端引入Nde I，下游同源臂的5'端引入Xho I，在上游同源臂与Kan抗性基因之间 引入酶切位点Hind III和BamH I)。将融合片段与载体pUCm-T进行连接，通过卡那抗性平 板进行筛选，将验证正确的质粒进行Nde