Zeocin的3ml YH)液体培养基中，30°C， 270rpm摇床培养18h，8000rpm离心5min，去上清，收集细胞沉淀，经沸水浴lOmin，-80°C 冻存30min，再沸水浴lOmin，4000rpm离心5min，上清用做PCR筛选的模板。PCR反应体积 为12.5 41，含10\丁&9缓冲液1.25 41，2.5臟〇1/1(1犯13141，1(^111〇1/^1的〇-卩&(^(^ 与swd-r引物各0. 25 μ I，Taq DNA聚合酶（5U/ μ 1) 0. 1 μ 1，模板1 μ 1，加灭菌去离子水至 12·5μ1。PCR 扩增条件为 95°C 3min;94°C 30s，55°C 40s，72°C 40s，共 30 个循环；72°C 10!1^11。电泳检测？〇?产物中有目标带的为阳性菌株8￥(1/?64?2€[4/63115(见图4)。将 阳性菌株接种至3ml含0. lmg/ml的Zeocin的ΥΗ)液体培养基培养，在30 °C条件下，270 rpm摇床培养24h，按1:100转接至IOml新ΥΗ)液体培养基，继续培养，将培养72h的菌液 经8000rpm，离心5min，收集表达上清进行TCA (三氯乙酸）沉淀。TCA沉淀基本步骤：向含 有870 μ 1上清EP管中加入130 μ 1的100% TCA，颠倒10次混匀。样品置于冰浴中大于 0. 5h，14000rpm，离心15min，可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控 几下，除去残余在管口的液体。14000rpm，离心2min，尽量吸去管底残余的液体，注意不要 吸到沉淀，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率。加入1XSDS-PAGE Loading buffer，95°C加热5min，一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20 μ 1枪头 轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余TCA。TCA沉淀出的样 品用SDS-PAGE检测，选出有目标蛋白表达的阳性菌株115 (见图5 )。
[0030] 重组蛋白在毕赤酵母中的高密度分泌表达与纯化 1)制备种子：将选出的阳性表达菌株划线接种到YPD平板(含Zeocin 0. lmg/ml)上， 30 °C培养72h后，挑取单菌落接种到3ml YH)液体培养基中，30 °C，270rpm，摇床培养24h，按 1:100转接至50ml新YH)液体培养基里（按< 10 %装瓶），同样条件下继续培养24h，在无 菌条件下取样检测，镜检无杂菌即可作为菌种。
[0031] 2)发酵表达：将种子液4000rpm离心5min，去上清，收集细胞沉淀，全部转移至 200ml新YH)液体培养基中（按彡10%装瓶），30°C，270rpm摇床培养，每隔24h取样lml， 用SDS-PAGE检测表达水平，确定最佳表达时间为72h。将最佳表达时间的培养液4°C， 12000rpm离心15min，收集上清，冻干浓缩，用无菌水溶解后进行SDS-PAGE检测（见图6)，该 上清中获得了比较纯的SWD重组蛋白。
[0032] 效果验证试验 1. 表达蛋白的活性检测。
[0033] 1)抑菌活性检测：将以上制备的含SWD重组蛋白表达产物的发酵上清液用 0. 22 μ m滤膜抽滤，取10 μ 1抽滤待检液浸透直径约0. 5cm的滤纸片，加盖到菌板（由处于对 数期的菌液8 μ 1与8ml的PB培养基混匀制成)上，37°C培养18h，揭掉滤纸片，检测样品抑 菌圈的大小(见表2)。结果证明此发酵上清液对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有抑菌 活性。
2. 抑蛋白酶活性检测：接种枯草芽孢杆菌于5ml液体LB中，37°C摇床培养12h，稀 释后取10 μ 1涂平板，过夜培养长出单菌落。挑枯草芽孢杆菌的单菌落于奶粉固体培养 基(脱脂奶粉和琼脂粉各1%)上，取10 μ 1抽滤除菌待检液浸透直径约〇. 5cm的滤纸片， 盖到菌落上，28°C培养24 h，观察并拍照记录抑蛋白酶的透明带，结果见图7。也可以用 96孔酶标板检测含表达产物的发酵上清液对枯草蛋白酶A的抑制活性。方法：反应液是 0· lmol/1 Tris_Hcl，pH=8· 0,枯草蛋白酶 A 的底物是 IMm 的 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-pHe p-nitroanilide(AAPF，Sigma)，25 μ 1枯草蛋白酶A，含表达产物的发酵上清液50 μ 1，37°C 孵育15min，加入50%乙酸终止反应，用酶标仪测405nm的吸光度OD4id5，计算枯草蛋白酶A在 不同浓度含表达产物的发酵上清液中的酶活性百分比。活性百分比=B/AX 100% (A为无抑 制剂(对照）的〇D4(]5, B为加发酵上清液的OD4ffi。与对照相比，随着加发酵上清液样品浓度 的提高，测得的样品的OD 45。数值变小，抑酶活性明显。结果见图8。
【主权项】
1. 一种酵母重组表达可溶性中国对虾SWD抗菌肽的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 毕赤酵母重组表达载体的构建：根据中国对虾SWD抗菌肽基因的cDNA序列，设计一 对上下游引物swd-f与swd-r，以其为模板，PCR扩增sro基因片段，将扩增的sro基因片段 与表达载体pGAPZα-A分别用AcoRI与AbiI双酶切，把酶切产物纯化连接，转化大肠杆 菌DH5α感受态细胞，转化子在含有〇.lmg/ml的Zeocin的低盐LB平板上生长，经PCR筛 选阳性克隆、摇菌提质粒、进行PCR与测序验证质粒中插入的基因序列正确后，即为构建好 的sro/pGAPZα-A重组表达质粒； (2) 酵母转化与阳性表达菌株的筛选：新制备毕赤酵母GS115感受态细胞，用BspHI 酶切构建好的srJ/pGAPZα-A重组表达质粒，使其线性化，酚氯仿抽提并乙醇沉淀回收线 性化的质粒，用脉冲电转化仪电转化新制备的毕赤酵母GS115感受态细胞，然后接种至含 有0.lmg/ml的Zeocin的YPD平板上，PCR筛选阳性克隆，转接阳性克隆到含0.lmg/ml的 Zeocin的YH)液体培养基里，30°C，270rpm振荡培养24h，按1:100比例转接到新的YPD 液体培养基中，同样条件下继续培养72h，离心收集酵母发酵液上清，经TCA沉淀的上清用 SDS-PAGE检测，有SWD目标蛋白表达带的即为阳性表达菌株； (3) SWD重组蛋白的表达与纯化：将筛选出的阳性表达菌株接种到含Zeocin0.lmg/ m的YH)液体培养基中，30°C，270rpm振荡培养至12h，按1:100比例转接到含Zeocin 0.lmg/ml的YPD液体培养基中，同样条件下继续培养24h，离心收集细胞，制备种子，转 接到新鲜YH)培养基里，同样条件下继续培养到表达高峰出现，将发酵液12000rpm离心 15min，4°C，收集上清，冻干浓缩，得SWD重组蛋白； 所述sro/pGAPZα-A的核苷酸序列如SEQ:ID:N0:1所示； 所述swd-f的核苷酸序列如SEQ:ID:N0:2所示； 所述swd-r的核苷酸序列如SEQ:ID:N0:3所示。
【专利摘要】本发明属于基因产品与应用领域，涉及一种毕赤酵母重组表达可溶性中国对虾SWD抗菌肽的方法，包括以下步骤：1）构建<i>swd</i><i>/PGAPZ</i><i>α</i><i>-A</i>重组表达载体；2）获得高表达的毕赤酵母菌株<i>swd</i><i>/PGAPZ</i><i>α</i><i>-A/</i>GS115；3）建立最优的酵母发酵培养与表达条件；4）SWD重组蛋白纯化；5）SWD重组蛋白活性检测。本发明建立了一种用酵母真核表达系统简单而高效生产与制备SWD抗菌肽的方法，使用该方法生产的SWD抗菌肽溶于水，活性高，易于纯化回收，同时具有抗菌与蛋白酶抑制活性的双重功能，具有工业化生产的优势，在饲料与食品添加剂以及日用化工与卫生药物领域有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N15/12, C12N15/81, C07K14/435
【公开号】CN105385705
【申请号】CN201510667490
【发明人】李殿香, 栾圆圆, 于洋
【申请人】济南大学
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月16日