GGTACC ATCGAAGGAAGAATGATGAACCGTCGTCCCCGCAT ;Lip-3 反向引物：AAGCTTGTACGTAGAACTAGTTCAAC CCAGGGCGGCTTC ;Lip-4 正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGCGCTGGATGCATCGCCTG ;Lip-4 反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTTCAGCCACGGCTGCACCCGTC ;Lip-5 正向引物：GGTACCATC GAAGGAAGAATGATGGCACACCCCAAAACCGA ;Lip-5 反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTCTAGGAAG GGGGATAGACCGC ;Lip-6 正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGAGTAACTGGCCTTATCCCCGTAT ; Lip-6 反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGITTAAGGCTGGAAATCCGGCCCGA ;Lip-7 正向引物：GG TACCATCGAAGGAAGAATGATGGCCGGCATGAGCGAGG ;Lip-7 反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTT CAGGCCAGCGCGGCCCA ;Lip-8 正向引物：GGATCCATCGAAGGAAGAATGATGTCAGTGCTGAACGCGTC ; Lip-8 反向引物：AAGCTTGTACGTAGAACTAGTTCAGGCCAGITTGGGTGAC)，分别扩增 8 个酯酶 / 脂 肪酶基因片段，得到大小为1869bp的PCR扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示， 将序列1所示的基因命名为Lip-Ι，其中，序列1中的1-1869为OFR，编码由622个氨基酸 残基组成的蛋白质，将该蛋白命名为脂肪酶Lip-Ι，脂肪酶Lip-I的氨基酸序列为序列2。
[0075] 实施例2、脂肪酶Lip-I的获得及转酯活性测定
[0076] -、脂肪酶Lip-I的获得
[0077] 1、融合表达载体pET32a-sole-Lip_l的获得
[0078] 将序列3插入pET32a载体（Novagen, 69015-3)的Bgl II和Sac I酶切位点之 间，且保持pET32a载体的其他序列不变，得到融合表达载体pET32a-S〇le-Lip-l (图1)，其 中序列3中第464-2332位为Lip-I基因，第23-442位为芝麻来源的油体蛋白sole基因 (GenBank accession No. AF091840)，Lip-I 基因的 N 端和油体蛋白的 C 末端通过 Linker 相连。融合表达载体pET32a-sole-Lip-l表达融合蛋白sole-Lip-1，融合蛋白sole-Lip-1 的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0079] 2、脂肪酶Lip-I的获得
[0080] (1)将融合表达载体pET32a-sole_Lip-l转化大肠杆菌Escherichia coli表达菌 株BL21 (DE3)(北京博迈德基因技术有限公司，CC0602)中。
[0081] (2)在无菌操作台中用牙签挑取包含质粒pET32a-sole-Lip_l的大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)单菌落，接种在 5mL 含氨节青霉素 （Amp 100yg/mL)的 LB 液 体培养基中，并于37°C恒温振荡箱中培养。
[0082] (3)待菌液浓度达到0D_= 0· 6时按1 %的接种量接种到5mL的含氨苄青霉素 (Amp 100 μ g/mL)的LB液体培养基中，并于37°C恒温振荡箱中培养至0D6。。= 0. 4时，加入 终浓度为1.0 mM IPTG，16°C诱导表达16-20h，得到诱导后的菌液，离心，收集菌体。
[0083] (4)将步骤（3)中收集的菌体进行超声破碎（功率：50w，破碎5s，间隔5s)，离心 收集上清和沉淀，该沉淀为融合蛋白sole-Lip-1。
[0084] (5)将步骤（4)获得的上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。
[0085] SDS-PAGE检测结果如图2所示：蛋白电泳结果表明脂肪酶Lip-I主要以包涵体的 形式表达，脂肪酶Lip-I与油体的融合蛋白的分子量大小为102. 4kDa。其中，M:Unstained Protein Mff Marker ;l:pET32a-空载 IPTG 诱导（上清）；2:pET32a-空载 IPTG 诱导（沉 淀）；3:pET32a-sole-Lip-l IPTG 未诱导（上清）；4:pET32a-sole-Lip-l IPTG 未诱导（沉 淀）；5:pET32a-sole-Lip-l IPTG诱导（上清）；6:pET32a-sole-Lip-l IPTG诱导（沉淀）。
[0086] 二、脂肪酶Lip-I的纯化和固定化
[0087] 取诱导后的菌液（含质粒pET32a-sole-Lip-l的BL21(DE3)菌株）2mL于EP管中， 13300 X g 4°C离心lmin，收集菌体，弃掉培养基，再用ImL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7. 5)重 悬，超声波处理（功率：50w，破碎5s，间隔5s，超声处理在冰浴上进行）30个循环，向超声EP 管中加入300 μ g大豆卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司，69014994)和30 μ L的橄榄油 (国药集团化学试剂有限公司，69018028)，用移液器混匀，再超声波处理（功率：50w，破碎 5s，间隔5s，超声处理在冰浴上进行）15个循环；冰上放置5min。然后超声波处理20s (功 率：50w)，冰上放置5分钟，重复两次后15000rpm离心20min收集上层油体，即为固定化脂 肪酶Lip-1。
[0088] 三、固定化脂肪酶Lip-I的转酯活性测定
[0089] 将上述步骤二获得的固定化脂肪酶Lip-I转入到含有200 μ L橄榄油和6mL正己 烷的带试管塞的大试管中，并加入0.6_〇1的甲醇，得到转酯反应体系。然后将转酯反应体 系在37°C，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯（生物柴油）。采用GC-MS 测定转酯酶活，以转酯率定义酶活，转酯率的测定方法参照文献"Bai FW，Yan W，Zhang SJ, Yu D, Bai LH. Immobilized lipase of reconstructed oil bodies and its potential application in biodiesel production[J]· Fuel. 2014;128:340-6"中的方法。根据撤榄 油的组成成分选择的标准品如下：棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯；同时 还选取了一个橄榄油中不含有的脂肪酸，即十三酸甲酯。以不加入固定化脂肪酶Lip-I的 转酯反应体系为空白对照。
[0090] 标准品和脂肪酶Lip-I转酯反应生成的脂肪酸甲酯以及空白对照的TIC峰图如图 3所示：标准品能够被气象色谱分离开并被质谱检测（表1，图3A)，与空白对照（表3,图 3B)相比，脂肪酶Lip-I转酯反应得到的脂肪酸甲酯的量是空白对照的6. 04倍（表2,表4， 图3C)。说明了 Lip-I具有转酯酶活性。
[0091] 表1、GC-MS标准品彳目息
[0093] 表2、脂肪酶Lip-I转酯酶活结果
[0094]
[0095] 表3、空白对照
[0097] 表4、脂肪酶转酯反应比较结果
[0099] 四、脂肪酶Lip-I有机溶剂耐受性
[0100] 按照有机溶剂的不同，分为如下6组通过GC-MS检测上述步骤二获得的脂肪酶 Lip-I在6个转酯反应体系中的相对转酯率：
[0101] l、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-l、6mL正己烷、200 μL橄榄油、终浓度为 0. 6mmol的甲醇和水（体积分数为1% )混匀，得到转酯反应体系1 ;然后在37°C，200rpm的 恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
[0102] 2、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-l、6mL叔丁醇、200 μ L橄榄油、终浓度为 0. 6mmol的甲醇和水（体积分数为1% )混匀，得到转酯反应体系2 ;然后在37°C，200rpm的 恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
[0103] 3、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-l、6mL石油醚、200 μ L橄榄油、终浓度为 0. 6mmol的甲醇和水（体积分数为1% )混匀，得到转酯反应体系3 ;然后在37°C，200rpm的 恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
[0104] 4、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-l、6mL叔戊醇、200 μ L橄榄油、终浓度为 0. 6mmol的甲醇和水（体积分数为1% )混匀，得到转酯反应体系4 ;然后在37°C，200rpm的 恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
[0105] 5、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-l、6mL正己烷/叔戊醇（正己烷与叔戊醇体 积比为4:1)、200 μ L橄榄油、终浓度为0. 6mmol的甲醇和水（体积分数为1 % )混匀，得到 转酯反应体系5 ;然后在37°C，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯