一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种嵌合病毒，特别涉及一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 黄热病是一种由黄热病毒感染引起的、主要发生在非洲亚撒哈拉地区和南美洲热 带地区的蚊媒传染病，发病率大约为20万例/年，致死率高达20-50 %，其中90 %发生在 非洲。黄热病毒感染人后可导致从亚临床感染到威胁生命的多器官衰竭、黄疸和出血等多 种临床症状，其对于居住在疫区的居民和到疫区的旅行者来说都是一种严重的公共健康威 胁。由于目前并没有针对黄热病的有效的抗病毒药物，进行黄热疫苗接种是预防感染唯一 有效的方式。目前，通常使用的疫苗为黄热减毒活疫苗（17D株）。
[0003] 黄热减毒活疫苗（17D株）在全球范围内使用已有70多年的历史，免疫一针有 效率可以达到90 % -99 %，但是近年来因黄热病疫苗接种引起的嗜内脏和嗜神经性的 严重不良反应报告逐渐增多，截止2013年，疑似由于黄热疫苗接种（YF17D株）引起的 严重不良反应多达629例，其中已被证实与疫苗接种有关、符合布莱顿协作（Brighton Collaboration)标准的有 131 例，死亡 25 例（Vaccine. 2013Dec 16 ;31 (52) :6201-9·)。该 情况的发生已经引起了国际社会的广泛关注。因此，研发一种更为安全但保护效果好的黄 热疫苗是目前市场的一种迫切需求。然而，目前未见毒性YF17D株小且保护效果好的黄热 疫苗的报道。
[0004] 嵌合病毒是利用一些已知特性的病毒株作为受体，以另一个病毒株作为供体提供 结构蛋白基因替换掉受体株的相应位置的基因构建得到的重组病毒，供体株的结构蛋白基 因包含和中和抗性细胞接触融合内化作用血凝作用等有关的抗原决定簇，这样产生的嵌合 病毒的生物特性由两者共同决定。利用稳定的减毒株作为受体株，嵌合进供体株相应的结 构基因，从理论上推断，在供体株和受体株的基因仅有简单叠加而无重组的情况下，制得的 嵌合病毒可以在一定程度上降低毒性，但是同时免疫原性和免疫保护作用也会降低；然而， 大量事实证明，重组后嵌合病毒的特性往往并非两种病毒基因的简单叠加，两种不同来源 基因会发生重组进而导致许多特性的变化，如，导致嵌合病毒的毒性不仅没有降低，反而大 大强于母体株的毒力。因此，获得毒性降低且免疫保护作用仍然较好的嵌合病毒非常不容 易，具有极大的偶然性。
[0005] 目前，未见以黄热病毒作为供体株制备可以预防黄热病的黄热嵌合病毒的报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种以乙脑病毒减毒株SA14-14-2为框架的乙 脑/黄热嵌合病毒。
[0007] 本发明首先提供了一种乙脑/黄热嵌合病毒的cDNA克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本发明乙脑/黄热嵌合病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本发明还提供了乙脑/黄热嵌合病毒在制备预防黄热病的疫苗中的用途。
[0010] 本发明还提供了预防黄热病的疫苗，它是以前述的嵌合病毒为活性成分，加上药 学领域可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。
[0011] 本发明还提供了前述疫苗在制备预防黄热病的药物中的用途。
[0012] 本发明以含有乙脑病毒减毒株SA14-14-2的特定感染性克隆为框架，将其中的 prM/E基因替换为黄热病毒YF17D株的prM/E，制备得到了特定序列的乙脑/黄热嵌合病毒 的cDNA克隆，并进一步转录得到了特定RNA序列的乙脑/黄热嵌合病毒Chimeri-JYF。
[0013] 与母体株黄热病毒17D株相比，本发明嵌合病毒Chimeri-JYF(核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示）的毒性大大降低，而且免疫保护作用相同。本发明嵌合病毒Chimeri-JYF(核 苷酸序列如SEQ ID N0:2所示）的毒性小，免疫保护作用好，用其制备的疫苗可以有效预防 黄热病毒感染，而且安全性好，可用于替代目前的黄热减毒活疫苗（17D株），在保证免疫保 护效果的同时，有效提高临床使用的安全性，应用前景良好。
[0014] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0015] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0016] 图I pACNR-JEV5'及pACNR-JEV3'半分子构建示意图
[0017] 图2乙脑病毒SA14-14-2全长克隆pJFC质粒结构示意图
[0018] 图3 pJFC全长质粒酶切鉴定图谱
[0019] 图4恢复病毒r JEV的RT-PCR鉴定
[0020] 图5 JEV恢复病毒细胞病变特征
[0021] 图6免疫荧光检测rJEV
[0022] 图7 JEV恢复病毒与疫苗株蚀斑形态比较
[0023] 图8乙脑/黄热嵌合片段5'半分子质粒pJE/YF-5'的构建
[0024] 图9乙脑/黄热嵌合全长克隆构建及鉴定
[0025] 图10 Chimeri-JYF转染PHK细胞病变特征
[0026] 图11免疫荧光鉴定恢复病毒Chimeri-JYF
[0027] 图12 Chimeri-JYF在BHK21细胞上蚀斑形态
[0028] 图13 Chimeri-JYF在原代地鼠肾细胞的生长曲线
[0029] 图14 Chimeri-JYF免疫对小鼠免疫保护作用
[0030] 具体实施实例
[0031] 实施例1本发明嵌合病毒的构建
[0032] 一、含JEV疫苗株SA14-14-2全长感染性全长cDNA克隆的构建、鉴定及重组病毒 的恢复
[0033] 1、低拷贝质粒pACNR多克隆位点的改造
[0034] 分别溶解 01 igo-1 (5, -CGCGCCATTAGGCGCCTTATAGATCTAATGTCCGGATTATGGATCCTGA TTGATCATTATTCTAGAATTAC-3'，下划线处依次为 KasI、Bglll、BspEI、BamHI、Bell、XbaI 识 别位点）和 01ig〇_2(5' -TCGAGTAATTCTAGAATAATGATCAATCAGGATCCATAATCCGGACATTAGATCTA TAAGGCGCCTAATGG-3'，与Oligo-I形成互补双链后，5'和3'端分别形成AscI和Xhol酶切 后粘端，皆由上海英潍捷基生物技术有限公司）于100 μ 1灭菌双蒸水中，各取10 μ 1混合， 加热到100°C后自然冷却，取2 μ 1与用AscI和Xhol双酶切的pACNR于4°C连接过夜（限 制性内切酶和连接试剂盒皆为美国NEB公司产品），转化感受态细胞TOPlO (天根生化科技 (北京）有限公司），挑取氨苄青霉素抗性克隆抽提质粒做测序鉴定（上海英潍捷基生物技 术有限公司）。
[0035] 测序结果表明：酶切位点被植入质粒的多克隆区，完成了质粒的多克隆区的位点 改造，为进一步克隆全长cDNA做好准备。
[0036] 2、JEV疫苗株SA14-14-2病毒RNA的抽提
[0037] JEV SA14-14-2疫苗病毒由成都生物制品研究所有限责任公司生产，按说明书溶 解JEV SA14-14-2冻干粉剂，取400 μ 1病毒液用Roche公司生产的RNA抽提试剂盒（High pure viral RNA kit)进行RNA的抽提（按说明书进行），RNA保存于-80°C备用。
[0038] 3、病毒cDNA的逆转录
[0039] 将提取的病毒RNA(分别取11 μ 1)分别用两条引物 RR5 (5' -GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3'）和 RR 1 3 (5' -AGATCCTGTGTTCTTCCT CACCACCAGCTACA-3'）逆转录病毒 cDNA,所用试剂盒为 Invitrogen 公司 Superscript? III Reverse Transcriptase，引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，方法参照试剂盒说 明书进行。
[0040] 4、病毒cDNA片段的PCR扩增及测序
[0041] 取2 μ 1病毒cDNA为模板，分别用引物Fl和RU F2和R3、F4和R4、F5和R6、 F7和R8、F9和R10、Fll和Rll配对扩增相应的cDNA片段（表1)，所用DNA聚合酶为 TaKaRa公司的PrimeSTAR，用降落PCR(Touch_down PCR)进行扩增，扩增条件为：98°C2min ; 98 cC lOsec，58. 5 cC - 53. 5 cC 10sec72 cC kb/min，10 循环；98 cC IOsec 53. 5 cC lOsec， 72°C kb/min，20循环；72°C lOmin。扩增的DNA片段用TaKaRa公司的DNA聚合酶LA进行加 八反应：10父1^1311打6114 1，(1犯1314 1，0嫩7.5 4 1，1^0.5 4 1，721€3〇11^11.反应结束， 直接与TaKaRa公司的T载体pMD19-T进行连接反应。2Xligation buffer 5yl，pMD19-T ΙμL，加 A的PCR产物3μ1，Iigase 1μ1，4Γ连接过夜。连接产物铺于含有氨苄青霉素、 IPTG和X-gal的LB平板，次日，挑取无色菌落增菌培养，抽提质粒进行酶切和测序鉴定。
[0042] 结果显示：以cDNA为模板，扩增出了与理论大小相应的7个DNA片段，大小分别为 0· 5kb，2. 2kb，0. 8kb，2. lkb，I. 5kb，2. lkb，I. 8kb。并且，7 个片段都成功克隆到 pMD19-T，测 序结果表明：除了片段1和2人为引入的沉默突变以外，所有片段均无碱基突变、插入和缺 失。
[0043] 表1克隆所用引物
[0044]
[0045] 5、含有JEV 5'半分子（碱基1-3450)质粒和3'半分子（碱基3335-10977)的构 建及酶切鉴定
[0046] 将5'端的3个扩增片段（大小分别为0· 5kb，2. 2kb，0. 8kb)的TA克隆分别用AscI 和KasI、KasI和Bglll、BglII和BspEI双酶切后，回收目的片段，依次克隆到低拷贝质粒 pACNR中，得到含有JEV 5'半分子质粒pACNR-JEV5'（l-3450nt)。把所扩增的3'端4个 DNA片段（大小分别为2. lkb，I. 5kb，2. lkb，I. 8kb)的TA克隆分别用限制内切酶BspEI和 BamHI、BamHI和Bell、BclI和XbaI、XbaI和XhoI双酶切后，回收目的片段，依次克隆到低 拷贝质粒pACNR中，得到含有JEV 3'半分子的质粒pACNR-JEV3'（3445-10977nt)。（图1) 结果表明：3个大小不同的DNA片段被成功克隆到低拷贝质粒中。
[0047] 6、含JEV病毒全长cDNA的构建及鉴定
[0048] 分别用BspEI和XhoI双酶切质粒pACNR-JEV3'，回收7. 5kb大小的DNA片段，与用 相同酶切的低拷贝质粒PACNR5'连接，筛选鉴定重组子，即为含乙脑病毒SA14-14-2基因组 的全长cDNA克隆质粒，命名为pJFC(1-10977)。（见图2)。
[0049] 用QIAGEN公司的大提试剂盒（QIAfilter Plasmid Maxi Kit)大量提取质粒，送 上海英潍捷基生物技术有限公司测序，并同时用限制性内切酶对质粒进行酶切鉴定。
[0050] 结果表明：酶切结果与理论相吻合，出现4941，4498, 2000, 1392, 613和138等8条 预期条带，见图3 ;测序结果表明：除人为引入的C蛋白基因第378个核苷酸的沉默突变以 外，其余各部分无碱基突变、插入和缺失。
[0051] 7、JEV全长感染性cDNA克隆的体外转录、转染及JEV恢复病毒（rJEV)的获得及 传代
[0052] 于37°C用Xhol消化pJFC约3h后，加入绿豆核酸酶于30°C作用30min，加入终 浓度为lg/L的SDS灭活绿豆核酸酶，PCR产物回收试剂盒回收线性化的酶切片段，以回收 片段为模板，用美国Promega公司体外转录试剂盒（Promega RiboMAX Large Scale RNA Production Systems_SP6)体外转录 RNA,并用 QIAGEN公司 RNA 回收试剂盒（RNAeasy mini kit)回收RNA，电转染BHK21细胞（电转染条件为140伏电压），并转移至T-25培养瓶于 37°C、5%的C02培养5d，至出现明显细胞病变，用冻融法收集培养液上清，命名为rJEV。取 第一代（Pl)病毒上清于BHK21细胞做病毒滴度测定。并用上清接种BHK21细胞，收获上清 的方法进行病毒传代。
[0053] 结果显示：转染BHK21细胞5天，可见细胞出现病变（图4)。病毒滴度约为 6. 01gPFU/ml，在原代地鼠肾细胞上传代rJEV恢复病毒滴度可达7. 21gPFU/ml，与疫苗株相 似。
[0054] 8、重组病毒rJEV的RT-PCR鉴定
[0055] 取p3代病毒上清，用罗氏公司高纯度病毒RNA抽提试剂盒（High Pure Viral RNA Kit)抽提 rJEV 病毒 RNA,用引物 RR5 (5, -GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3'）和 RR13 (5, -AGATCCT GTGTTCTTCCTCACCACCAGCTA CA-3'）逆转录病毒cDNA，以此为模板，分别用引物Fl和R3、F4 和R5、F6和R7、F8和R9、FlO和RlO、Fll和Rll配对进行PCR扩增，所得PCR片段纯化后 送上海英潍捷基生物技术有限公司进行序列测定。
[0056] 结果表明：PCR片段大小与理论相吻合（大小分别为2. 6kb，2. lkb，I. 8kb，I. 7kb， 1.0 kb，I. 8kb)，见图5,测序结果表明C蛋白基因第378位碱基含有人为引入的沉默突变 (A - C)，其余各处未发现碱基突变。
[0057] 9、免疫荧光鉴定恢复病毒
[0058] 接种3 X IO4个LLC-MK2细胞到96孔板中，次日，待细胞长成单层，按10 3PFU/孔接 种P3代病毒到孔中，于37°C、5%的C02培养2天，吸去培养液，PBS洗涤1次细胞，加入甲 醇室温固定20min，弃去甲醇，PBS洗涤3次，加入0. 2% Tritonx-IOO室温透膜lOmin，PBS 洗涤1次，加入抗JEV E蛋白单克隆抗体（1:10,美国Abeam公司），37°C孵育lh，PBS洗涤 3次，加入FITC标记的羊抗小鼠二抗（1:100,美国Santa Crus公司），37°C孵育lh，PBS洗 涤3次，荧光显微镜观察并拍照，见图6。
[0059] 10、rJEV在BHK21细胞上的蚀斑形态
[0060] 在六孔板中培养BHK21细胞，待细胞融合度达80% -90%左右，接种p3代重组病 毒和疫苗株，37°C吸附lh，覆盖物用终浓度为10g/L的低熔点琼脂糖，于37°C、5% C02培养 5d后用10g/L的结晶紫染色检测病毒滴度、蚀斑形态和大小。
[0061] 结果表明：rJEV和JEV疫苗株SA14-14-2在BHK21细胞上可以形成大小形态相似 的蚀斑，见图7。
[0062] 11、rJEV神经毒力的检测
[0063] 分别用0· 03ml (含病毒3. 51gPFU)和0· 02ml (含病毒3. 31gPFU)病毒液接种4周 龄BALB/c小鼠和3-5天的BALB/c乳鼠各10只，饲养14天，观察病毒对乳鼠和小鼠的神经 毒力（表2)。结果表明