利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一 种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法。
【背景技术】
[0002] 蜘蛛种类繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112个科，3905个属，44000多种。 蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌的一种天然高分子蛋白纤维，具有优良的机械性能，如弹性好、强 度大、韧性强、耐高温和低温、耐冲击、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等优良特性， 其独特的综合性能是其他天然纤维和合成纤维所无法相比的。典型的蜘蛛丝有7种类型， 分别由7种不同丝腺分泌的不同的蛋白质分子组成。其中由大囊状腺（Major ampullate gland)分泌的主牵引丝（dragline silk)，呈放射状分布，构成蜘蛛网基本框架。牵引丝的 强度是钢的5倍，因而拥有"生物钢"之美誉。牵引丝的蛋白基因是高度保守的，主要由分 子量350kDa左右的、成对的牵引丝蛋白I(MaSpl)和牵引丝蛋白2 (MaSp2) 2种蛋白组成。
[0003] 黑寡妇蜘蛛（Latrodectus hesperus)牵引丝蛋白I (MaSpl)基因具有一个 单一外显子，全长9390bp，编码3129个氨基酸，基因含有大量的重复单元，每1个重 复单元由4种初级类型重复序列Typel、Type2、Type3和Type4通过头尾串联而成 (Typel-Type2-Type3_Type4)，而每1种初级类型重复序列都包含了典型的（GA)n、An和GGX 蛋白基序。MaSpl被认为是牵引丝具有很强强度的主要分子基础。
[0004] 黑寡妇蜘蛛（Latrodectus hesperus)牵引丝蛋白2 (MaSp2)基因具有一个单一外 显子，全长11340bp，编码3779个氨基酸，基因含有大量的重复单元，每一个重复单元主要 由2种初级类型重复序列以Typel-Typel-TypM串联而成，而每一种初级类型重复序列都 包含了典型的An、GPGXX和GGX蛋白基序。MaSp2被认为是牵引丝具有很强韧性的主要分 子基础。
[0005] 由于蜘蛛丝自身的产量低，且由于其相互残杀而不能通过大规模的饲养获得批量 的蜘蛛丝，所以限制了蜘蛛丝的广泛应用。随着生物技术的快速发展和对蜘蛛丝的编码序 列及吐丝机理的深入了解，已有采用各种异源表达系统来表达蜘蛛丝蛋白的研究，异源表 达系统包括大肠杆菌、酵母（Pichia pastoris)、昆虫细胞（sf9、BmN)、仓鼠的肾脏细胞、转 基因土豆、转基因烟草、转基因山羊、转基因老鼠、以及转基因家蚕。
[0006] 但是，至今为止使用的各种异源表达系统表达出来的蜘蛛丝蛋白1的分子量较 小，有较多重组蛋白缺少一些关键的蛋白基序，有较多蛋白不是纯的蜘蛛丝蛋白分子，而是 与荧光蛋白等分子融合的融合蛋白，这些因素最终影响了外源蛋白的机械性能，而且至今 为止使用的各种异源表达系统都没有表达过蜘蛛牵引丝蛋白2。因此，现有技术缺少了一种 方法能同时合成、分泌出黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蜘蛛丝。
【发明内容】
[0007] 为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种将能够合成、分 泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的转基因家蚕品种杂交，育成杂交品种。另一方面进一 步通过同蛾区阳性个体自交留种，选择出2个牵引丝蛋白基因都纯合的品种。利用转基因 家蚕技术结合杂交育种技术，将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因同时导入家蚕基因 组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2 的家蚕，获得以家蚕丝为本底的黑寡妇蜘蛛牵引丝，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用 于提高蚕丝的机械性能。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
[0009] (1)通过转基因育成带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵 引丝蛋白1的转基因家蚕和带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引 丝蛋白2的转基因家蚕；
[0010] (2)将上述两种转基因家蚕品种杂交，育成Fl代杂交品种；
[0011] (3)将Fl代杂交品种同蛾区个体自交留种为F2代，F2代家蚕采用单蛾育，筛选出 荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕饲养，采用同蛾区蚕蛾相互交配制 成F3代；
[0012] (4)F3代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下所有个体全部表达红色荧光 DsRed标记基因的蚕蛾在同一蛾区饲养，并同时采用Western Blot技术检测，筛选出同时 表达黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蛾区的蚕蛾相互交配制成F4代；
[0013] (5)F4代开始均采用与F3代同样的方法饲养、筛选、制种，一直到F8代，育成两个 黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白基因都纯合的家蚕品种；
[0014] (6)通过家蚕丝腺细胞同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2,并随家蚕 吐丝结茧行为进入蚕茧。
[0015] 所述步骤（1)带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋 白1的转基因家蚕采用以下方式培育获得：
[0016] Al)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSpl质粒作为在家蚕丝腺中 表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因载体，pBac [3xP3_DsRed]-MaSpl质粒以piggyBac转座 子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和作为标记基因的红色荧光DsRed 基因表达框；
[0017] A2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBaC[3XP3-DSRed]-MaSpl质粒及能够提供 piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1 :1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的 受精卵内，利用pBac[3xP3_DsRed]-MaSpl质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝 蛋白1基因插入到家蚕基因组内；
[0018] A3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为Gl代，在 Gl代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的 转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
[0019] A4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基 因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
[0020] A5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配， 制成G4代；
[0021] A6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕 蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合、 能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕。
[0022] 所述的质粒pBac[3xP3_DsRed]_MaSpl是以piggyBac转座子为基础并带有Amp 抗性基因，包括PiggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个 功能表达框，一个功能表达框是3 X P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3 X P3 Promoter-DsRed-SV40,另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋 白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和家蚕丝素蛋白重链基因3'末端的表达 框，艮P Fibroin H chain Promoter-Fibroin H chain signal peptide-MaSpI-Fibroin H chain PolyA0
[0023] 所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白I基因是包含2倍到16倍MaSpl基因重复单元 Typel_Type2-Type3_Type4,1 倍的 MaSp2 基因重复单元 Typel_Type2-Type3_Type4 喊基序 列如 SEQ ID Nd 1。
[0024] 所述步骤（1)带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋 白2的转基因家蚕采用以下方式培育获得：
[0025] BI)采用分子生物学方法构建PBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒作为在家蚕丝腺中 表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因载体，pBac[3xP3-DsRed]_MaSp2质粒以piggyBac转 座子为基础包含有作为外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和作为标记基因的红色 荧光DsRed基因表达框；
[0026] B2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBaC[3XP3-DSRed]-MaSp2质粒及能够提供 piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1 :1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的 受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]_MaSp2质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝 蛋白2基因插入到家蚕基因组内；
[0027] B3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G