一种抗牙周病抗体的制备方法及其应用

文档序号:9660001阅读:346来源:国知局
一种抗牙周病抗体的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学技术领域,具体是一种牙周病抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002]对于口腔疾病,人们想到最多的就是龋齿。然而最新的一项调查显示,目前在发展中国家,牙周病的发病率已经超过龋齿的发病率,高达75%以上。而牙周病主要的致病菌,被公认为是牙銀卟啉单胞菌。目前对牙銀卟啉单胞菌进行被动免疫的措施是,将单一的或混合的牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白作抗原,免疫马牛羊兔等哺乳类动物,从动物血清中提取抗体,进行被动免疫防治。

【发明内容】

[0003]本发明的目的是提供一种抗牙周病菌抗体IgG的制备方法,使抗体的生产成本降低,抗体效价提高。本发明的另一目的,是抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG的应用。提供以本发明制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG和抗菌剂作为被动免疫有效成份用于预防牙周病的发生。
[0004]采用的技术方案是:
1、一种抗牙周病菌抗体的制备方法,其特征在于包括下述步骤:
(1)取牙龈卟啉单胞菌,在BHI培养基中厌氧培养5-7天;将培养好的牙龈卟啉单胞菌进行离心处理,收集菌体,用PH6-7、浓度为0.05-0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗涤菌体4-6次,50-65°C的温度下,加热25-35分钟,进行灭活处理,得到牙龈卟啉单胞菌液;
将牙龈卟啉单胞菌液和等量的福氏佐剂混合,用高速匀浆器处理,制得菌体佐剂抗原;
(2)、根据脯乳类动物种类,每次取牙龈卟啉单胞菌抗原1-5ml,对动物进行淋巴结和背部皮下多点注射,共注射三次,每次间隔三周;末次免疫后20天,经检测效价合格后采集血清,取免疫血清搅拌下加入适量盐水稀释,调节pH值至7.5-8.5,加入等量饱和硫酸铵溶液,在2-8°C温度下静置20-30小时,高速离心20-30分钟,取其沉淀,经复融超滤浓缩除盐、除菌后冷冻干燥,即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG粗提物;
(3)、将抗牙銀卟啉单胞菌抗体IgG粗提物离心纯化后,再经DEAE-SephadexA50层析柱纯化;用含NaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱,收集各蛋白洗脱峰,并以ELISA检测各蛋白的抗体活性;收集有抗体活性的蛋白洗脱液,调节蛋白含量为20mg/ml;
将前一步骤所得的蛋白洗脱液再经Sephadex G200凝胶柱层析纯化,用含NaCl的磷酸缓冲液进行洗脱,收集各蛋白洗脱峰,并以ELISA检测各蛋白的抗体活性;收集有抗体活性的蛋白洗脱液,经0.22μ膜过滤除菌,冷冻干燥,即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG纯品。
[0005]上述离心纯化的速度为5000-12500rpm,离心次数2-5次,DEAE阴离子交换层析法中,洗脱液磷酸缓冲液的浓度为0.003-0.02M,所含NaCl的浓度为0.03-0.1M,凝胶过滤柱层析洗脱液磷酸缓冲液浓度为0.01-0.2M,所含NaCl的浓度为0.1-0.5M;亲和层析洗脱液浓度为0.1-0.5M。
[0006]上述牙龈卟啉单细胞,用BHI培养基,在37°C温度厌氧条件下,静置培养牙龈卟啉单胞菌5-7天,将培养后的牙龈卟啉单胞菌用4000rpm离心10分钟,收集菌体;用pH值为6.0、浓度为0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗菌体5次,50°C、25分钟加热灭活处理,制得牙龈卟啉单胞菌液。取菌液(20亿/ml),与等量的福氏佐剂混合,用高速匀浆器处理,制得牙龈卟啉单胞囷佐剂抗原。
[0007]根据哺乳动物种类,每次取菌体佐剂抗原1-5ml,对动物进行淋巴结和皮下多点注射,共注射三次,每次间隔三周;
第三次免疫动物后20天,检测效价合格后,收集抗血清用盐水稀释,调节pH值至8.0,搅拌下加入等量饱和硫酸铵溶液置2_8°C静置24小时,8000rpm离心20分钟,取沉淀,经超滤除盐、浓缩、除菌后冷冻干燥,制得抗牙周病菌抗体IgG粗提物;
将抗牙周病菌抗体IgG粗提物经DEAE-Sephadex A50层析柱层析;柱床2.5 X 35cm,加入10mg/ml的样3.0ml,用含0.07M NaCl的0.01M、pH7.0磷酸缓冲液进行洗脱,流速20ml/h,洗脱液按每管5.0ml;收集各蛋白洗脱峰,并以ELISA检测各蛋白的抗体活性;收集有抗体活性的蛋白洗脱液,调节蛋白含量为20mg/ml ;继而将该液进一步经Sephadex G200凝胶柱层析;柱床2.0 X 65cm,加样1.5ml,用含0.1M NaCl的0.01M、pH7.0磷酸缓冲液进行洗脱,流速
8.0ml/h,洗脱液按每管5.0ml,收集各蛋白洗脱峰,并以ELISA检测各蛋白的抗体活性;收集有抗体活性的蛋白洗脱液,经0.22μ膜过滤除菌,冷冻干燥,即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG纯品。
[0008]用本发明方法制得的抗牙周病抗体的应用:
本发明制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG用于抗牙周病菌产品的添加剂,使用量为5-20g/Kg。其产品为以抗牙周病菌抗体IgG为有效成份的防牙周病的组合物。
[0009]牙龈卟啉单胞菌是引起牙周病的主要菌种,且对其它菌种有一定的交叉免疫反应。选择牙龈卟啉单胞菌作为主要抗原菌体,避免了混合菌作抗原时,主要菌效降低的问题,也避免了单一菌种作抗原时,范围偏窄的问题。保证了抗体具有较大范围的交叉反应。
[0010]经检测表明本发明抗体IgG达到了 PAGE纯度,经分子量测定,抗体IgG分子量为160,000道尔顿。
[0011]抗体IgG理化实验结果表明,本发明抗体IgG在65°C条件下,90分钟内仍保持有活性;在pH4-l 1的环境中,37°C、8小时其抗体活性无明显变化,但在pH2和pH12时抗体活性迅速下降,并且很快失活;本发明抗体IgG具有较大的抗渗透压性质,可耐受40%的蔗糖渗透压。
[0012]抗体IgG间接血凝抑制实验表明,本发明抗体IgG能有效地抑制牙銀卟啉单胞菌凝聚,其效价高达1:512;抗体IgG抑制牙龈卟啉单胞菌粘附实验观察表明,本发明的抗体IgG稀释到1:8,仍具有明显的抑制牙龈卟啉单胞菌在牙体表面的粘附作用;动物实验表明,用本发明抗体IgG喂养感染牙龈卟啉单胞菌的大白鼠,能有效地防止牙周病的发生,检测表明菌斑中牙龈卟啉单胞菌数下降了 70-80%。
[0013]本发明的防牙周病组合物为液体状态时,可将其装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用。
[0014]本发明抗体IgG还可与牙齿着色除去剂、预防口臭剂等蛀牙预防剂配合,制成各种防治产品。也可以加入到各种口腔清新剂中,增加口腔清新剂的防牙周病功能。
[0015]进一步的具体应用包括:
1、用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG,加入山梨酸钾、苯甲酸钠两种抗菌剂中至少一种作为有效成份的防牙周病组合物,包括牙膏、口含液、漱口水和喷雾剂型的口腔用产品,或是口香糖、巧克力、雪糕、冰激凌食物,本发明抗体IgG的加入量为0.05-0.2%,山梨酸钾、苯甲酸钠的加入量为0.01-0.02%。
[0016]2、采用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG,制备口含液的方法,是取本发明抗体IgG2.0g,山梨酸钾0.15g,苯甲酸钠0.15g,阿斯巴甜0.8g,薄荷脑0.15g,苹果香精
0.4ml;将薄荷脑加入100ml的蒸馏水中,60°C溶化;其它固体成份各溶解于450ml的蒸馏水中,然后将各种溶解的液体均匀混合,用蒸馏水定容到1000ml,即得。
[0017]3、用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体I gG,制备口香糖的方法,是取本发明抗体IgG2.0g,山梨酸钾0.15g,阿斯巴甜0.8g,薄荷脑0.15g,微囊化苹果香精0.4g,胶基10.0g,羟甲基纤维素5.0g,按总量1千克,即得。
[0018]4、用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG,制牙膏的方法,是取本发明抗体IgG0.lg,山梨酸钾0.015g,苯甲酸钠0.015g,甘油10.0g,山梨糖醇8.0g,羟甲基纤维素
2.(^,龙须菜1.38,月桂基硫酸钠1.88薄荷脑0.0158,阿斯巴甜0.0158,草莓香精0.051111,磷酸钙二水物47.8g,将羟甲基纤维素、龙须菜加入约60ml的蒸馏水中,泡胀溶解,再先后加入其它成份,充分搅拌,使混合均匀,最后加入蒸馏水定容至100ml,搅拌均匀成膏状,即得。
[0019]5、用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体I gG,制备护齿膏的方法,是取本发明抗体IgG0.lg,苯甲酸钠0.0lg,蜂蜡8.0g,硬脂酸10.0g甘油单硬脂酸酯2.0g,甘油10.0g,羟甲基纤维素l.0g,薄荷脑0.0lg,阿斯巴甜0.05g,蒸馏水68.80!111,草莓香精0.028,将蜂蜡、硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、甘油混合,加热至70°C,混合溶解之液体称之为A液;将羟甲基纤维素溶解于50ml的蒸馏水中,泡胀溶解,再先后加入抗体IgG、薄荷脑、阿斯巴甜、山梨酸钾、草莓香精,充分搅拌,混合均勾,继而加入冷却后的A液,最后加入蒸馈水定容至100ml,搅拌均匀成膏状,即得。
[0020]本发明抗体IgG制备技术生产成本低,抗体效价高,抗渗透压强,对牙銀卟啉单胞菌具有较强的免疫活性,且对牙龈卟啉单胞菌以外的致病菌具有很大范围的交叉反应。本发明的防牙周病组合物,具有抗体IgG用量小,使用安全,能有效地防止牙周病的发生。
【具体实施方式】
[0021 ] 实施例一
用BHI培养基,37°C厌氧条件下,静置培养牙龈卟啉单胞菌5-7天,将培养后的牙龈卟啉单胞菌用4000rpm离心10分钟,收集菌体用pH 6.浓度为0.2M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体5次,经25分钟加热(50°C)灭活处理,得到牙龈卟啉单胞菌液。取菌液(20亿/ml)加入等量的福氏佐剂,用高速匀浆器处理,制得油包水状菌体佐剂抗原。
[0022]根据脯乳类动物的不同种类,每次取菌体佐剂抗原1-5ml,对动物进行淋巴结和皮下多点免疫,共免疫三次,每次间隔三周。
[0023]第三次免疫动物后20天采血测定抗体效价,达到标准后开始收集抗血清,用盐水稀释,调节pH值至8.0,搅拌下加入等量饱和硫酸铵溶液,置2-8°C静置24小时,8000rpm离心20分钟,取沉淀,经超滤除盐、浓缩、除菌后
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