一种抗牙周病抗体的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学技术领域，具体是一种牙周病抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002]对于口腔疾病，人们想到最多的就是龋齿。然而最新的一项调查显示，目前在发展中国家，牙周病的发病率已经超过龋齿的发病率，高达75%以上。而牙周病主要的致病菌，被公认为是牙銀卟啉单胞菌。目前对牙銀卟啉单胞菌进行被动免疫的措施是，将单一的或混合的牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白作抗原，免疫马牛羊兔等哺乳类动物，从动物血清中提取抗体，进行被动免疫防治。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种抗牙周病菌抗体IgG的制备方法，使抗体的生产成本降低，抗体效价提高。本发明的另一目的，是抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG的应用。提供以本发明制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG和抗菌剂作为被动免疫有效成份用于预防牙周病的发生。
[0004]采用的技术方案是:
1、一种抗牙周病菌抗体的制备方法，其特征在于包括下述步骤:
(1)取牙龈卟啉单胞菌，在BHI培养基中厌氧培养5-7天;将培养好的牙龈卟啉单胞菌进行离心处理，收集菌体，用PH6-7、浓度为0.05-0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗涤菌体4-6次，50-65°C的温度下，加热25-35分钟，进行灭活处理，得到牙龈卟啉单胞菌液；
将牙龈卟啉单胞菌液和等量的福氏佐剂混合，用高速匀浆器处理，制得菌体佐剂抗原；
(2)、根据脯乳类动物种类，每次取牙龈卟啉单胞菌抗原1-5ml，对动物进行淋巴结和背部皮下多点注射，共注射三次，每次间隔三周；末次免疫后20天，经检测效价合格后采集血清，取免疫血清搅拌下加入适量盐水稀释，调节pH值至7.5-8.5，加入等量饱和硫酸铵溶液，在2-8°C温度下静置20-30小时，高速离心20-30分钟，取其沉淀，经复融超滤浓缩除盐、除菌后冷冻干燥，即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG粗提物；
(3)、将抗牙銀卟啉单胞菌抗体IgG粗提物离心纯化后，再经DEAE-SephadexA50层析柱纯化;用含NaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱，收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性;收集有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml;
将前一步骤所得的蛋白洗脱液再经Sephadex G200凝胶柱层析纯化，用含NaCl的磷酸缓冲液进行洗脱，收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性;收集有抗体活性的蛋白洗脱液，经0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG纯品。
[0005]上述离心纯化的速度为5000-12500rpm，离心次数2-5次，DEAE阴离子交换层析法中，洗脱液磷酸缓冲液的浓度为0.003-0.02M，所含NaCl的浓度为0.03-0.1M，凝胶过滤柱层析洗脱液磷酸缓冲液浓度为0.01-0.2M，所含NaCl的浓度为0.1-0.5M;亲和层析洗脱液浓度为0.1-0.5M。
[0006]上述牙龈卟啉单细胞，用BHI培养基，在37°C温度厌氧条件下，静置培养牙龈卟啉单胞菌5-7天，将培养后的牙龈卟啉单胞菌用4000rpm离心10分钟，收集菌体;用pH值为6.0、浓度为0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗菌体5次，50°C、25分钟加热灭活处理，制得牙龈卟啉单胞菌液。取菌液(20亿/ml)，与等量的福氏佐剂混合，用高速匀浆器处理，制得牙龈卟啉单胞囷佐剂抗原。
[0007]根据哺乳动物种类，每次取菌体佐剂抗原1-5ml，对动物进行淋巴结和皮下多点注射，共注射三次，每次间隔三周；
第三次免疫动物后20天，检测效价合格后，收集抗血清用盐水稀释，调节pH值至8.0，搅拌下加入等量饱和硫酸铵溶液置2_8°C静置24小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀，经超滤除盐、浓缩、除菌后冷冻干燥，制得抗牙周病菌抗体IgG粗提物；
将抗牙周病菌抗体IgG粗提物经DEAE-Sephadex A50层析柱层析;柱床2.5 X 35cm，加入10mg/ml的样3.0ml，用含0.07M NaCl的0.01M、pH7.0磷酸缓冲液进行洗脱，流速20ml/h，洗脱液按每管5.0ml;收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性;收集有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml ；继而将该液进一步经Sephadex G200凝胶柱层析；柱床2.0 X 65cm，加样1.5ml，用含0.1M NaCl的0.01M、pH7.0磷酸缓冲液进行洗脱，流速
8.0ml/h，洗脱液按每管5.0ml，收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性;收集有抗体活性的蛋白洗脱液，经0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG纯品。
[0008]用本发明方法制得的抗牙周病抗体的应用:
本发明制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG用于抗牙周病菌产品的添加剂，使用量为5-20g/Kg。其产品为以抗牙周病菌抗体IgG为有效成份的防牙周病的组合物。
[0009]牙龈卟啉单胞菌是引起牙周病的主要菌种，且对其它菌种有一定的交叉免疫反应。选择牙龈卟啉单胞菌作为主要抗原菌体，避免了混合菌作抗原时，主要菌效降低的问题，也避免了单一菌种作抗原时，范围偏窄的问题。保证了抗体具有较大范围的交叉反应。
[0010]经检测表明本发明抗体IgG达到了 PAGE纯度，经分子量测定，抗体IgG分子量为160,000道尔顿。
[0011]抗体IgG理化实验结果表明，本发明抗体IgG在65°C条件下，90分钟内仍保持有活性;在pH4-l 1的环境中，37°C、8小时其抗体活性无明显变化，但在pH2和pH12时抗体活性迅速下降，并且很快失活;本发明抗体IgG具有较大的抗渗透压性质，可耐受40%的蔗糖渗透压。
[0012]抗体IgG间接血凝抑制实验表明，本发明抗体IgG能有效地抑制牙銀卟啉单胞菌凝聚，其效价高达1:512;抗体IgG抑制牙龈卟啉单胞菌粘附实验观察表明，本发明的抗体IgG稀释到1:8，仍具有明显的抑制牙龈卟啉单胞菌在牙体表面的粘附作用；动物实验表明，用本发明抗体IgG喂养感染牙龈卟啉单胞菌的大白鼠，能有效地防止牙周病的发生，检测表明菌斑中牙龈卟啉单胞菌数下降了 70-80%。
[0013]本发明的防牙周病组合物为液体状态时，可将其装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用。
[0014]本发明抗体IgG还可与牙齿着色除去剂、预防口臭剂等蛀牙预防剂配合，制成各种防治产品。也可以加入到各种口腔清新剂中，增加口腔清新剂的防牙周病功能。
[0015]进一步的具体应用包括:
1、用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG，加入山梨酸钾、苯甲酸钠两种抗菌剂中至少一种作为有效成份的防牙周病组合物，包括牙膏、口含液、漱口水和喷雾剂型的口腔用产品，或是口香糖、巧克力、雪糕、冰激凌食物，本发明抗体IgG的加入量为0.05-0.2%，山梨酸钾、苯甲酸钠的加入量为0.01-0.02%。
[0016]2、采用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG，制备口含液的方法，是取本发明抗体IgG2.0g，山梨酸钾0.15g，苯甲酸钠0.15g，阿斯巴甜0.8g，薄荷脑0.15g，苹果香精
0.4ml；将薄荷脑加入100ml的蒸馏水中，60°C溶化;其它固体成份各溶解于450ml的蒸馏水中，然后将各种溶解的液体均匀混合，用蒸馏水定容到1000ml，即得。
[0017]3、用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体I gG，制备口香糖的方法，是取本发明抗体IgG2.0g，山梨酸钾0.15g，阿斯巴甜0.8g，薄荷脑0.15g，微囊化苹果香精0.4g，胶基10.0g，羟甲基纤维素5.0g，按总量1千克，即得。
[0018]4、用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG，制牙膏的方法，是取本发明抗体IgG0.lg，山梨酸钾0.015g，苯甲酸钠0.015g，甘油10.0g，山梨糖醇8.0g，羟甲基纤维素
2.(^，龙须菜1.38，月桂基硫酸钠1.88薄荷脑0.0158，阿斯巴甜0.0158，草莓香精0.051111，磷酸钙二水物47.8g，将羟甲基纤维素、龙须菜加入约60ml的蒸馏水中，泡胀溶解，再先后加入其它成份，充分搅拌，使混合均匀，最后加入蒸馏水定容至100ml，搅拌均匀成膏状，即得。
[0019]5、用本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体I gG，制备护齿膏的方法，是取本发明抗体IgG0.lg，苯甲酸钠0.0lg，蜂蜡8.0g，硬脂酸10.0g甘油单硬脂酸酯2.0g，甘油10.0g，羟甲基纤维素l.0g，薄荷脑0.0lg，阿斯巴甜0.05g，蒸馏水68.80!111，草莓香精0.028，将蜂蜡、硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、甘油混合，加热至70°C，混合溶解之液体称之为A液;将羟甲基纤维素溶解于50ml的蒸馏水中，泡胀溶解，再先后加入抗体IgG、薄荷脑、阿斯巴甜、山梨酸钾、草莓香精，充分搅拌，混合均勾，继而加入冷却后的A液，最后加入蒸馈水定容至100ml，搅拌均匀成膏状，即得。
[0020]本发明抗体IgG制备技术生产成本低，抗体效价高，抗渗透压强，对牙銀卟啉单胞菌具有较强的免疫活性，且对牙龈卟啉单胞菌以外的致病菌具有很大范围的交叉反应。本发明的防牙周病组合物，具有抗体IgG用量小，使用安全，能有效地防止牙周病的发生。
【具体实施方式】
[0021 ] 实施例一
用BHI培养基，37°C厌氧条件下，静置培养牙龈卟啉单胞菌5-7天，将培养后的牙龈卟啉单胞菌用4000rpm离心10分钟，收集菌体用pH 6.浓度为0.2M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体5次，经25分钟加热(50°C)灭活处理，得到牙龈卟啉单胞菌液。取菌液(20亿/ml)加入等量的福氏佐剂，用高速匀浆器处理，制得油包水状菌体佐剂抗原。
[0022]根据脯乳类动物的不同种类，每次取菌体佐剂抗原1-5ml，对动物进行淋巴结和皮下多点免疫，共免疫三次，每次间隔三周。
[0023]第三次免疫动物后20天采血测定抗体效价，达到标准后开始收集抗血清，用盐水稀释，调节pH值至8.0，搅拌下加入等量饱和硫酸铵溶液，置2-8°C静置24小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀，经超滤除盐、浓缩、除菌后