一种支链脂肪酸微量分离富集方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品加工技术领域，涉及一种脂肪酸微量分离富集方法，更具体地涉 及一种支链脂肪酸的微量分离富集方法。
【背景技术】
[0002] 支链脂肪酸（branchedchainfattyacid，BCFA)是一类碳骨架上带有一个或多 个支链（主要是甲基）的脂肪酸，通常是饱和脂肪酸。BCFA分为单支链和多支链脂肪酸。 单支链脂肪酸（monomethylBCFA)的甲基位置对分子构型非常重要，如果甲基位于脂肪酸 分子碳链骨架倒数第2个碳原子上，形成的结构称为iso-构型，如果甲基位于脂肪酸分子 碳链骨架倒数第3个碳原子上，形成的结构称为anteiso-构型。类萜支链脂肪酸在碳链内 部有多个支链，如植烷酸及其α-氧化产物降植烷酸。
[0003]BCFA广泛的存在于大自然中。许多水鸟羽毛上附着的蜡类物质就是由带有甲基的 支链脂肪酸和甲基脂肪醇组成的。这些对水鸟来说十分重要的蜡可以保护水鸟适应各种气 候的变化，使其羽毛处于最佳状态；同时，这些带有支链的脂肪酸酯蜡在皮肤上形成的薄膜 是透气性的，因此它也使水鸟皮肤的呼吸得以通畅。在反刍动物的乳脂以及内部组织中有 特定含量与种类的BCFA，这些BCFA主要是来自于反刍动物瘤胃中的细菌，还有一部分来源 于动物器官自身合成。支链脂肪酸在绝对大多数的植物中含量都很低，主要存在于植物体 表的蜡质当中。BCFA还是微生物细胞膜的主要成分（尤其是耐极端温度微生物）。在人体 中，支链脂肪酸多存在于皮肤及其分泌物中，如胎皮脂（BCFA占干重的10~20% )。近年 来，各种研究证明BCFA是新生儿胃肠道的主要成分，与肠道菌群定植有关。BCFA在人体内 部组织中含量很少（除了人眼睑的睑板腺），在人乳中含量最高可达1.5% (wt/wt)左右。
[0004] 由于特殊的支链结构，支链脂肪酸及其衍生物具有特有的理化性质，如较低的冻 点和倾点、良好的热稳定性和氧化稳定性，其衍生物有较高的水解和溶解稳定性，支链脂肪 酸及其盐有较大的溶解度等。BCFA在体内与直链酸不同的消化代谢途径，使其具有独特的 生理调控功能。油脂中的脂肪酸主要是由直链饱和脂肪酸、直链不饱和脂肪酸和一些含有 支链及特殊官能团的脂肪酸组成的混合物。通常，前两种脂肪酸含量在绝大多数油脂中占 主导地位，因此从混有直链脂肪酸的脂质中直接分离检测出含量极低的支链脂肪酸难度很 大。所以，有研究者们通过先去除其中的直链脂肪酸，将支链脂肪酸富集后再检测。目前， 支链脂肪酸的分离富集方法都是用尿素甲醇/乙醇溶液结晶去除饱和直链脂肪酸，后用硝 酸银硅胶薄层或者多次尿素溶液分离不饱和直链脂肪酸，富集得到支链脂肪酸含量相对较 高的脂肪酸混合物。这些溶剂法耗时2天以上，试剂消耗大，上样量大，操作复杂，且直链脂 肪酸去除率低。
【发明内容】
[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部 分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0006] 鉴于上述和/或现有支链脂肪酸微量分离富集方法中存在的问题，提出了本发 明。
[0007] 因此，本发明的一个目的是提供一种新型的支链脂肪酸微量分离纯化方法，脂质 经过衍生化、尿素溶液包合、尿素硅胶薄层制备、尿素硅胶薄层分离、硝酸银硅胶薄层制备、 硝酸银硅胶薄层分离步骤制得支链脂肪酸含量相对很高的脂肪酸产品。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种支链脂肪酸微量分离富集 方法，其原料经过衍生化、尿素溶液包合、尿素硅胶薄层板制备、尿素硅胶薄层展开与提取、 硝酸银薄层板制备、硝酸银薄层展开与提取步骤，从天然可食用脂质中富集得到支链脂肪 酸，其包括，
[0009] 将油脂原料衍生化为脂肪酸甲酯：取一定量油脂于试管，加入KOH-NaOH溶液， 65°C皂化30min，加入BF3-CH30H，70°C条件下酯化3~5min，加入正己烷后，再加入饱和 NaCl后取上层液体，加入无水硫酸钠，离心10000rpm/5min，取上清，氮气吹干得到脂肪酸 甲酯；
[0010] 尿素溶液包合：尿素按照体积比1 : 4比例加入到纯甲醇中，于65°C加热，待尿素 完全溶解，加入所述脂肪酸甲酯，搅拌溶解完全，继续加热20min后，冷却到室温，放置于低 温下保存后，过滤分离尿素包合物，滤液用等体积石油醚萃取2次，每次萃取lOmin，石油醚 层用〇. 5倍量的5%NaCl溶液洗涤，石油醚层用无水硫酸钠脱水后，真空旋转蒸发溶剂； [0011] 尿素硅胶薄层板制备：将硅胶薄层板，浸入尿素甲醇饱和溶液中，取出于通风厨晾 干30min，制备得尿素硅胶薄层板，立即使用；
[0012] 尿素硅胶薄层展开与提取：取所述尿素溶液包合中分离得到的脂肪酸甲酯在尿 素硅胶薄层板上展开，点样后待出现白色络合物，覆盖一层尿素甲醇饱和溶液，25°C烘干 5min，取出用第一展开剂展开，展开完毕，取出碘显色，待碘挥发后，刮出RF= 0. 63~0. 76 处甲酯条带，4mL无水乙醚提取，氮气吹干；
[0013] 硝酸银薄层板制备：在展开装置的一侧倒入乙腈，另一侧倒入20%硝酸银的乙腈 溶液，在所述20 %硝酸银的乙腈溶液的一侧放入硅胶薄层板，避光展开，展开完毕，取出避 光通风橱晾干，制备得硝酸银硅胶薄层板；
[0014] 硝酸银薄层展开与提取：将尿素硅胶薄层板分离得到的脂肪酸甲酯溶于氯仿在硝 酸银硅胶薄层板上用第二展开剂展开，取出碘显色，待碘挥发后，刮出饱和脂肪酸条带，无 水乙醚提取三次，氮气吹干，富含支链脂肪酸的脂肪酸产品。
[0015] 作为本发明所述的支链脂肪酸微量分离富集方法的一种优选方案，其中：所 述第一展开剂为正己烷、无水乙醚和乙酸，且满足体积比正己烷：无水乙醚：乙酸= 80 ： 20 ： 1〇
[0016] 作为本发明所述的支链脂肪酸微量分离富集方法的一种优选方案，其中：所述第 二展开剂为甲苯和正己烷，且满足体积比甲苯：正己烷=40 : 60。
[0017] 作为本发明所述的支链脂肪酸微量分离富集方法的一种优选方案，其中：所述尿 素溶液包合中，其中，加入所述脂肪酸甲酯，尿素与脂肪酸甲酯体积比例为4 : 1，包合温度 为4°C，包合时间2h。
[0018] 作为本发明所述的支链脂肪酸微量分离富集方法的一种优选方案，其中：所述尿 素硅胶薄层板制备中，尿素硅胶薄层板的浸泡时间为lmin，浸泡高度为8cm。
[0019] 作为本发明所述的支链脂肪酸微量分离富集方法的一种优选方案，其中：所述尿 素硅胶薄层展开与提取中点样，其点样方式为脂肪酸甲酯中加入按质量体积比为3 : 57的 尿素和甲醇。
[0020] 作为本发明所述的支链脂肪酸微量分离富集方法的一种优选方案，其中：所述硝 酸银薄层展开与提取中，饱和脂肪酸条带的相对位移为RF= 0. 714~0. 857。
[0021] 本发明的有益效果：本发明用尿素溶液包合预处理，用尿素硅胶薄层分离结合硝 酸银硅胶薄层分离法，充分利用两种分离方法的优点同时互相弥补各自的缺点，能够快速、 简便，且在上样量小的情况下，高效去除油脂中的直链脂肪酸，得到支链脂肪酸含量高的脂 肪酸产品的分离方法。
【具体实施方式】
[0022] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实 施方式做详细的说明。
[0023] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以 采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的 情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0024] 其次，此处所称的"一个实施例"或"实施例"是指可包含于本发明至少一个实现 方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的"在一个实施例中"并非均 指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0025] 实施例1
[0026] 以牛乳为原料，从牧场采集新鲜牛乳，-20°C运输，冻存于_80°C冰箱备用。
[0027] 取10ml上述牛乳样品于250ml烧瓶中，加入10ml无水乙醇，混合，加入25ml无水 乙醚，震荡lmin，加入25ml石油醚震荡30s，将上层液体倒入收集瓶。第二次抽提，步骤同 第一次将乙醇换成5ml，无水乙醚和石油醚换成15ml，收集上层液体。第三次抽提，步骤同 第二次，不加乙醇，收集上层液体。40°C真空旋转蒸发。
[0028]取 400mg牛乳脂于试管，加入 32mL0.5mol/LKOH-NaOH溶液，65°C皂化 30min， 加入32mLBF3-CH30H(1 : 3)，酯化3~5min(70°C)。加入4ml正己烷（色谱纯），震荡 3~4min。加入适量饱和NaCl，吸取上层于1. 5ml离心管中，加入少量无水硫酸钠，离心 10000rpm/5min，取上清，氮气吹干。
[0029] 尿素按照1 : 4比例加入到纯甲醇中，于65°C水浴加热，待尿素完全溶解，加入一 定量上述脂肪酸甲酯，搅拌溶解完全，继续加热20min后，冷却到室温，放置于低温下保存 后，过滤分离尿素包合物。滤液用等体积石油醚萃取2次，每次萃取lOmin。石油醚层