黄孢原毛平革菌在降解四环素中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学及生物降解领域，具体地说，涉及黄孢原毛平革菌在降解四 环素中的应用。
【背景技术】
[0002] 抗生素是指有细菌、霉菌或其他微生物在繁殖过程中产生的，能够杀灭或抑制其 他微生物的一类物质及其衍生物，用于治疗敏感微生物（常为细菌或真菌）所致的感染。 根据抗生素的使用量统计，1996年，全世界抗生素饲料添加剂的用量占全部饲料添加剂用 量的45. 8%，抗生素总产量的70%左右用于畜牧业；欧盟国家使用的兽药主要是抗生素和 杀寄生虫类药物，抗生素类兽药约占所有兽药用量的70%以上。在各个国家抗生素用量也 十分可观，据UCS(2001)报道，美国2000年的16200吨抗生素的消耗中，30%用于人类，而 70%用于动物；在丹麦，1997年抗生素总用量超过150吨，其中> 100吨用于畜禽的促生长 剂；在我国，四环素类抗生已成为畜禽养殖业中使用生产与使用量最大的抗生素，同时我国 也是世界上四环素类抗生素生产量最大的国家。由于人类对其过分地使用甚至是滥用，导 致这类化合物及其代谢产物被持续不断地排入地表水、地下水和土壤等环境介质中。虽然 这些化合物的暴露浓度通常相对较低，但由于其本身具有较强的持久性、生物反应活性及 难于生物降解性等特点，因此可以对人类和水生、陆生生物产生长期性的潜在危害影响。
[0003] 从微生物学角度出发，利用微生物的生长代谢、酶系统作用等降解水体中微量四 环素是一种简单、高效、快速的处理手段之一。因此，寻找一种微生物，首先能够在被四环素 污染的水体中能够存活；其次，能够高效、快速降解水体中的四环素，对于受污染水体的治 理具有十分重要的意义。张明美等用分子手段，对城市污水处理厂污泥微生物进行检测过 程中发现了四环素抗性基因的存在，并进一步提出传统的好氧/厌氧工艺对于抗生素抗性 基因有一定的削减作用，但并不明显。石义静等探究了好养硝化颗粒污泥对于四环素的降 解作用，研究表明初始四环素浓度为l〇、20、30mg/L时，生物降解作用占颗粒污泥对四环素 去除量的比例分别为34. 14%、51. 76%和44. 38%。宋现财等研究表明四环素初始浓度为 10mg/L时，活性污泥MLSS(污泥浓度）由400mg/L增加到2000mg/L，单位吸附量由21. 35mg/ g下降到5. 09mg/g，而吸附率却由80. 5%增加到94. 3%。
[0004] 四环素是一种广谱抑菌剂，其是从放线菌金色链丛菌（Streptomyces aureofa-ciens)的培养液等分离出来的抗菌物质，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤 过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，在我国广泛用于医疗、畜牧业、渔业 和种植等行业。城市污水处理厂被认为是四环素类抗生素主要汇集地和处理场所，而在国 家《污水综合排放标准》（GB8978-1996)中也仅对制药工业医药原料药的排水作出了限制 (1900m3/t)。目前，大多数学者的主要研究方向多集中在对于污水处理厂活性污泥微生物 活性的研究，希望能从中寻找到一条途径来降解、去除水体中微量的四环素。但从已报道的 文献资料可知，现有方法仍存在如下问题：（1)利用活性污泥吸附法来降低水体中四环素 浓度，这种方法并没有从根本上降低环境中四环素的含量，而残留在剩余污泥中的四环素 又会给环境带来二次污染的风险；（2)对于污水处理厂中各个工艺段的研究表明，污水处 理厂初级处理工艺对抗生素抗性基因的去除作用可以忽略；二级处理过程中的好氧/厌氧 工艺对于抗生素抗性基因有一定的削减作用，但并不明显；（3)利用分子手段，已从污水处 理厂活性污泥中发现了微生物对于四环素的部分抗性基因，这对从微生物学角度研究四环 素的降解、去除提供了新的思路，但此种方法的缺点是并不能从中分离得到能够降解四环 素的微生物活体或纯种，对具体操作并无实际指导意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供黄孢原毛平革菌在降解四环素中的应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)在降解四环素中的应用，特别是黄孢原毛平革菌在降解水体中微量四环素 中的应用。
[0007] 纯四环素在水体、液体培养基中48h内浓度基本不发生任何改变，而将配制好的 四环素水溶液加入至黄孢原毛平革菌培养液中，48h内则可检测到明显的降解。本发明通过 正交实验，确立了不同环境影响因素（pH、温度、生物量、四环素浓度）对于黄孢原毛平革菌 降解四环素效果的影响，并提出最优组合，进一步通过SPSS统计分析得出了不同环境影响 因素对于四环素降解率的贡献由大到小依次为四环素浓度（D) >pH(A) >生物量（C) >温 度⑶；pH不同水平对于降解率的贡献由大到小依次为Al>A2 >A3 ;温度不同水平对于 降解率的贡献由大到小依次为B2 >Bl>B3 ;生物量不同水平对于降解率的贡献由大到小 依次为C3 >Cl>C2 ;四环素浓度不同水平对于降解率的贡献由大到小依次为D3 >D2 > D1。当水体中pH为4,温度为35°C，黄孢原毛平革菌孢子数量为10X106个，四环素浓度为 9mg/L时，达到四环素最佳的降解率。
[0008] 本发明还提供黄孢原毛平革菌在降解食品原料或饲料中所含四环素中的应用。
[0009] 本发明还提供黄孢原毛平革菌在制备四环素生物降解剂中的应用。
[0010] 本发明还提供由黄孢原毛平革菌制备的四环素生物降解剂。其活性成分为黄孢原 毛平革菌的发酵液、由其发酵液制备的粗酶液、菌体裂解液或孢子悬液等。
[0011] 本发明中述及的黄孢原毛平革菌购自中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCCAF96007。
[0012] 本发明首次发现了能够降解四环素的微生物菌种，即黄孢原毛平革菌，利用该菌 的生物代谢、酶系统的作用，可简单、高效、快速的降低水体中四环素的含量。
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例2中48h液体培养基中四环素的浓度与吸光度之间的线性关 系图。
[0014] 图2为本发明实施例2中各因素不同水平组合的四环素去除率。
【具体实施方式】
[0015] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0016] 以下实施例中黄孢原毛平革菌购自中国典型培养物保藏中心（CCTCCAF96007)。
[0017] 实施例1黄孢原毛平革菌对水体中四环素的降解作用
[0018] 黄孢原毛平革菌的传代培养采用PAD培养基，扩大培养采用液体培养基（Kirk 培养基）。黄孢原毛平革菌于PAD培养基中进行传代培养，使用时将其孢子粉末从PAD 培养基上刮落于液体培养基中进行扩大培养48h。水体中的微量四环素采用盐酸四环素 (TetracyclineHydrochloride)模拟配水方式进行。考虑环境等因素可能对结果的影响， 设计正交实验考察如PH、温度、黄孢原毛平革菌生物量及水体中四环素浓度对降解效果的 影响。四环素降解前后浓度变化采用紫外/可见分光光度法检测，其降解计算公式如下：
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[0020] 式中，C。为四环素初始浓度（mg/L);C,为48h后四环素的浓度（mg/L)。
[0021] 各考察指标见表1，不同因素水平组合见表2。
[0022] 表1正交实验各因素水平
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[0024] 注：液体培养基中黄孢原毛平革菌生物量（孢子数量）为2X106个/mL。
[0025] 表2不同因素水平组合
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[0027] 进一步通过SPSS统