一种从脐带外层羊膜组织中分离培养脐带间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及脐带间充质干细胞的稳定分离提取方法，特别是从脐带外层羊膜组织中分离培养间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，存在于全身结缔组织和器官间质中。MSC于20世纪70年代末首次发现于骨髓中，然而直到上个世纪90年代，MSC多向分化潜能被人们认识后，这种干细胞才受到越来越多的关注。
[0003]间充质干细胞属于多能干细胞，目前已有研究表明，MSC可以经诱导分化为脂肪、骨、骨韧带、神经、肝、心肌、内皮、胰岛等多种组织细胞以及类细胞；并且发现，间充质干细胞在免疫抑制、内分泌系统调节、神经系统调节以及心血管功能改善等方面均具有明显的功效。
[0004]目前对间充质干细胞的提取研究也已较为广泛，包括从脂肪、骨髓、羊水、胎盘、脐带组织、脐带血、牙周等人体多种组织和器官中进行提取。其中脐带来源的间充质干细胞由于生长环境单一、体外提取方便，使得提取的间充质干细胞纯度高、数量大，可以成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，具有更广阔的临床应用潜能。
[0005]鉴于脐带多能干细胞的多向分化潜能以及在疾病治疗领域的应用潜力，目前国内市场的脐带间充质干细胞的存储业务具有广阔的前景，因此，如何高效规范的保证干细胞的分离提取率，以及保证干细胞优质，从而满足未来干细胞移植的临床需求，是目前国内干细胞存储业务亟待解决的问题。
[0006]目前脐带间充质干细胞多采用酶消化法和组织贴壁法来制备，然而在分离提取过程中，红细胞的干扰是影响脐带间充质干细胞质量和数量的重要因素，大量红细胞的存在使得间充质干细胞的生长空间受限，同时影响干细胞的活力状态，对脐带间充质干细胞分离提取与开发利用造成了很大的影响。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对本领域的需要，提供一种能够克服红细胞干扰的改进的脐带间充质干细胞分离提取方法。
[0008]本发明的另一目的是提供通过本发明的方法获得的脐带间充质干细胞。
[0009]具体而言，本发明针对目前国内外人脐带间充质干细胞的提取现状，利用红细胞裂解液并采取悬浮培养从新鲜脐带外层羊膜组织中分离原代间充质干细胞，利用无血清培养体系原代培养并进行稳定传代，以提高脐带间充质干细胞的分离提取成功率和细胞纯度，为人脐带间充质干细胞的临床应用提供可能。
[0010]本发明的技术方案如下。
[0011]—方面，本发明提供了从新鲜脐带离体组织外层羊膜中分离和提取间充质干细胞的方法，其为一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，所述方法包括:采用红细胞裂解液处理从脐带分离的外层羊膜组织，并采用间充质干细胞无血清培养基进行培养。
[0012]本发明采用的红细胞裂解液为包含NH4C1和Na2-EDTA的水溶液，优选为包含
l-20g/L 的 NH4C1 和 0.05-0.2mM Na2-EDTA 的水溶液，更优选为包含 5_10g/L 的 NH4C1 和0.1mM Na2-EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4。在使用之前，过0.22 μ m微滤膜，平衡至室温。
[0013]本发明采用的间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM_F12、β -巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物。
[0014]优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β -巯基乙醇、
0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a_MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F 12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β -巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。
[0015]根据本申请的【具体实施方式】，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司货号为11140的产品。
[0016]根据本申请的【具体实施方式】，所述血清替代物可以采用KnockOut?SerumReplacement (Gibco 公司产品，货号 10828-010)。
[0017]本发明的方法具体包括:将获得的外层羊膜组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后采用间充质干细胞无血清培养基培养获得的外层羊膜组织块，以获得原代间充质干细胞。
[0018]优选地，所述方法包括:将经清洗的脐带外层羊膜组织剪成1-3_3大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后将获得的组织块均匀铺在培养皿中达60-80%的覆盖，加入3-5倍组织块体积的间充质干细胞无血清培养基，在37°C和5%浓度的0)2下培养，3-5天时半量更换新鲜培养基，5-15天时待组织块下均匀爬出细胞后，去掉组织块，全量更换新鲜间充质干细胞无血清培养基继续培养，此后每3-4天进行一次新鲜培养基更换。
[0019]优选地，所述方法包括以下步骤:
[0020](1)脐带组织的预处理:
[0021]将新鲜脐带分割成小段，去除血管淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜组织，加入PBS缓冲液清洗；
[0022](2)红细胞裂解液处理:
[0023]将经步骤(1)获得的外层羊膜组织分割成组织块，加入红细胞裂解液处理，离心收集经处理的组织块，加入PBS缓冲液清洗；
[0024](3)原代培养:
[0025]采用间充质干细胞无血清培养基培养经步骤(2)获得的外层羊膜组织块，以获得原代间充质干细胞；
[0026]优选地，所述方法还包括以下步骤:
[0027](4)上清液检测:
[0028]取步骤⑶中培养细胞的上清液，检测以下项目中的一种或多种:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；
[0029](5)传代培养:
[0030]取步骤(4)中检测项目为阴性的培养细胞，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养，收集细胞备用、冻存或继续传代；
[0031](6)细胞检测:
[0032]取步骤(5)中培养的细胞，检测以下项目中的一种或多种:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。
[0033]优选地，所述步骤(1)包括:将新鲜脐带分割成2-3cm长的小段，去除血管中淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜组织，加入2-5倍体积的PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；
[0034]优选地，所述步骤⑵包括:
[0035]将经清洗的外层羊膜组织剪成1-3_3大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟，离心收集组织块，PBS缓冲液清洗2-3次；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟；
[0036]优选地，所述步骤(3)包括:
[0037]将经步骤(2)获得的组织块均匀铺在培养皿中达60-80%、优选70%的覆盖，加入3-5倍组织块体积的间充质干细胞无血清培养基，在37°C和5%浓度的0)2下培养，3-5天时半量更换新鲜培养基，5-15天、优选7-10天时待组织块下均匀爬出细胞后，去掉组织块，全量更换新鲜间充质干细胞无血清培养基继续培养，此后每3-4天进行一次新鲜培养基更换；
[0038]优选地，所述步骤(4)包括:
[0039]取步骤(3)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的全部:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；
[0040]优选地，所述步骤(5)包括:
[0041]取步骤(4)中全部检测项目为阴性的培养细胞，待贴壁细胞汇合率达30-80%、优选40-50%时，胰酶消化后离心收集细胞，采用间充质干细胞无血清培养基传代培养至汇合率达50-90 %、优选80-90 %，收集细胞备用、冻存或继续传代；其中优选地，所述胰酶的使用浓度为质量百分比为0.125%，消化1-2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁；并且其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟；
[0042]优选地，将收集的细胞以2-3X 106细胞/ml的密度冷冻保存在_196°C液氮中；或者优选地，将收集的细胞以1:3-1:4的比率进行细胞传代；
[0043]优选地，所述步骤(6)包括:
[0044]取步骤(5)中培养的细胞，检测以下项目中的全部:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。
[0045]优选地，所述方法中在步骤(1)之前还进行脐带清洗、保存和使用前处理，优选包括:
[0046]无菌条件下采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织，经表面无菌生理盐水清洗后，放入脐带保存运输液中，优选在6小时内冰上运输至洁净细胞实验室；在使用前，将新鲜脐带以75%乙醇水溶液冲洗2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次；
[0047]其中优选地，所述脐带保存运输液为包含注射用青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素B的无钙镁D-Hank’s液；更优选地，其中所述青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素的浓度为100-200U/mL，优选150U/ml ;两性霉素B的浓度为200_400U