黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的Indel标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术辅助育种技术领域，特别涉及一种黄瓜栅栏状表皮细胞基因 Pe的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
【背景技术】
[0002] 黄瓜栽培广泛，历史悠久，类型和品种十分丰富，根据果实用途，可将黄瓜分为鲜 食黄瓜和加工黄瓜。加工黄瓜对原材料果实有特殊的要求，一般要求瓜条顺直，皮色均匀， 肉质较厚，皮质紧密。黄瓜果实表皮细胞指黄瓜果实最外层的一层细胞，表皮细胞能减少果 实水分散失，保护果实免受物理伤害，位于表皮上的气孔能调节果实与外界气体的交换。不 同结构形状的表皮细胞对于果实所起的作用存在差异，栅栏状的表皮细胞结构能更好的保 护果实免受物理伤害，减少水分散失，同时使果实皮质紧密，更适合于加工；扁平状的表皮 细胞结构在保护果实免受物理伤害、减少水分散失以及使皮质紧密方面的效果相对较差。 [0003]目前，在黄瓜上与果实相关的性状（比如，瓜长、把长、刺瘤、棱、纹等）研究较多， 而对于黄瓜果实表皮细胞结构的研究极少，仅见一篇报道。1987年，国外学者Fanourakis 以具有栅栏状表皮细胞结构的加工型黄瓜和具有扁平状表皮细胞结构的鲜食性黄瓜为材 料，进行了果实栅栏状表皮细胞基因Pe的遗传分析，结果表明，杂交后代h的果实表皮细 胞呈栅栏状排列，匕群体出现了栅栏状结构和扁平状结构的分离，分离比符合栅栏状：扁平 状=3:1。结论认为，黄瓜果实栅栏状表皮细胞结构是由一个单基因（Pe)控制的，其中栅 栏状对扁平状为显性，且该基因与果色一致基因u、果瘤基因Tu、无光泽基因D有连锁关系。 截止目前，尚未见与Pe基因连锁的分子标记的报道。
【发明内容】
[0004] 基于本领域的上述空白，本发明的目的在于提供了一种与黄瓜果实栅栏状表皮细 胞基因Pe紧密连锁的Indel标记，并提供了该标记在筛选果实具有栅栏状结构表皮细胞的 加工黄瓜种质资源上的应用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] -种与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的Indel标记Indelpe02的引 物，其特征在于：具有如下核苷酸序列：
[0007] Indelpe02-F/Indelpe02-R：
[0008] TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG
[0009] 所述引物扩增的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带为125bp，其 核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示；
[0010] 所述引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带为130bp，其 核苷酸序列如SeqIDNo. 2所示。
[0011] 用于筛选包含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的试剂盒，其特征在于，包 括所述的Indel标记Indelpe02的引物。
[0012] 所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。
[0013]用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的方法，其特征在于，采用 所述的Indel标记Indelpe02的引物和/或所述的试剂盒进行如下步骤：
[0014] (1)采用所述Indel标记Indelpe02的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR 扩增；
[0015] (2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
[0016] (3)从检测结果中筛选出现与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记 特征条带一致的材料，所述与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带 为125bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示。
[0017] 所述PCR扩增的反应体系为：1. 5ng/μ1DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/ μ1，0.5μ1/μ1Go丨叫笈GreenMasterMix，其余为双蒸水。
[0018] 所述PCR扩增的反应程序为：94°C预变性4分钟；94°C变性15秒，55°C退火15秒， 72°C延伸30秒，35个循环；72°C保温5分钟，16°C保存。
[0019] 所述凝胶电泳检测指，采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分 离，最后银染显色。
[0020] 所述试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括所述的Indel标 记Indelpe02的引物，或
[0021] 在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有所述 的Indel标记Indelpe02的引物。
[0022] 组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂，或
[0023] 在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有PCR 反应和/或电泳所需的试剂。
[0024] 本发明提供一种与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的Indel标记 Indelpe02的引物，该引物的核苷酸序列如下：Indelpe02-F/Indelpe02_R:
[0025] TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG;所述引物扩增的与黄瓜果实栅 栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带为125bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示；所述 引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带为130bp，其核苷酸序列如 SeqIDNo. 2所示。采用本发明所述的Indel标记Indelpe02的引物对黄瓜材料进行PCR 扩增检测，能较为准确地测定待测材料中是否含有黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe，可被 有效地应用于含有Pe基因的黄瓜材料的分子标记辅助选择育种，从而省去了传统的依靠 显微镜观察细胞结构的辨别步骤，大大地节省了获得含有基因Pe的目标材料的筛选时间， 提高了育种效率。
[0026] 基于上述Indel标记Indelpe02的引物，本发明的一些实施例还提供了用于筛选 包含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求所述的 Indel标记Indelpe02的引物。进一步地，所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需 的试剂。采用试剂盒的形式能进一步完善本发明产品维度，提高本发明产品的便携度，有利 于所述Indel标记Indelpe02的引物的推广应用。
[0027] 在本发明的一些实施例中，本发明还提供了用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基 因Pe的黄瓜材料的方法，所述方法指，采用所述的Indel标记Indelpe02的引物和/或所 述的试剂盒进行如下步骤：（1)采用所述Indel标记Indelpe02的引物对待选黄瓜材料的 基因组DNA进行PCR扩增；（2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；（3)从检测结果中筛选出现 与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带一致的材料，所述与黄瓜果 实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带为125bp，其核苷酸序列如SeqID No. 1所示。采用本发明所述的Indel标记Indelpe02的引物和/或所述的试剂盒，通过上 述的步骤，能够较为快速、便捷、准确地获知待测黄瓜材料中是否含有果实栅栏状表皮细胞 基因Pe，而无需再对黄瓜材料的细胞结构进行观察，为育种工作节省了时间，提高了效率。
[0028] 具体地，所述PCR扩增的反应体系为：1.5ng/ylDNA模板，所述引物正向和反向 各 5ng/μ1，0· 5μ1/μ1GoTaqS".GreenMasterMix，其余为双蒸水。所述PCR扩增的反 应程序为：94°C预变性4分钟；94°C变性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35个循环； 72°C保温5分钟，16°C保存。所述凝胶电泳检测指，采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于 150V恒功率电泳分离，最后银染显色。上述试验参数是本发明根据引物的实际情况摸索调 试得出，在上述反应条件下能够使检测结果以最优的形式呈现，从而进一步地提高本发明 选择含有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的准确性。
[0029] 在本发明进一步地实施例中，本发明还请求保护所述的试剂盒的制备方法，任 何基于商业目的的生产、制造和/或销售所述试剂盒的行为均属于本发明请求保护的范 围。所述行为指，组装试剂盒的试剂中包括所述的Indel标记Indelpe02的引物，或在标 有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有所述的Indel标记 Indelpe02的引物。进一步地，组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试 剂，或在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有PCR反应 和/或电泳所需的试剂。
[0030] 本发明以果实具有扁平状结构表皮细胞的黄瓜高代自交系WI2757与果实具有栅 栏状结构表皮细胞的黄瓜高代自交系Wis.SMR18为亲本构建FpF2、BCVVΒ(^Ρ2群体，在盛 瓜期采摘商品瓜，制作果实横切面切片，在显微镜下观察商品瓜表皮细胞结构，进行遗传分 析。以？ 2群体为作图材料，利用BSA法和SSR及Indel标记技术，实现Pe基因在染色体上的 遗传定位，并获得紧密连锁的Indel标记Indelpe02,与Pe的遗传距离为3. 9cM。