72 °C延伸lOmin结束。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，割胶回收目的条带，连接 pEASY-BluntSimpleCloningVector(宝生公司）测序载体。提取质粒酶切鉴定之后，对阳 性质粒上的CRLR基因区域进行测序，将无突变的质粒命名为CRLRCDS-T。用Smal/BamHI双酶 切CRLR⑶S-T质粒，电泳分离并割胶回收目的片段，连入经实验室改造的pCAMBIA1300改载 体中（图4)(Jiaetal.2011)。通过酶切鉴定，获得阳性载体P35S::CRLR1。通过实施例2所述 的农杆菌介导法将CRLR1增强表达载体P35S: :CRLR1转化ar11突变体。获得一系列转基因苗， 通过潮霉素抗性基因检测、RT-PCR表明转基因苗CRLR1得到增强表达(图2D，2E)。
[0112] 备注说明：pCAMBIA1300改载体的改造方法如下:为在pCAMBIA1300载体的EcoRI及 Xmal两个酶切位点间接入一个35S启动子，在PstI及Hindlll两个酶切位点间接入一个N0S 终止子，见(Jia et al.2011)。
[0113]阳性转基因苗的RT-PCR鉴定如下：
[0114]选取10个潮霉素阳性株系和一个潮霉素阴性对照株系提取RNA，做反转录，用RT-PCR方法检测CRLR1的相对表达量。具体过程如下：
[0115] RNA提取采用天根公司的植物RNA提取试剂盒提取总RNA，实验分7步：1.将研钵研 杵于180°C烘烤2小时以除去RNase备用；2.取50-100mg植物样品速冻于液氮之中；3.在冷冻 状态下将样品充分研磨粉碎;4.加入提取液使细胞充分裂解;5.过滤除去组织碎片;6.纯化 层析柱中的RNA(去蛋白、去DNA、脱盐）；7.RNase-freeH20洗脱获取RNA。具体操作过程参照 试剂盒附带说明书。
[0116]cDNA的合成采用Invitrogen公司的Superscript IIRT试剂盒完成，反转录体系 中总RNA的用量为3yg，具体过程参照试剂盒附带说明书。
[0117] 用定量和半定量RT-PCR方法对阳性转化株系做鉴定，定量RT-PCR分析与实施例1 中qRT-PCR所述方法完全一致。半定量RT-PCR鉴定时，首先通过内参基因0sActinl(水稻肌 动蛋白）将各样品的cDNA浓度调到基本一致，再以调好浓度的样品为模板做PCR，扩增CRLR 基因的一段大小为234bp的序列。PCR产物在1.2% (m/v)的琼脂糖凝胶上电泳分离，然后用 GelDoc?XR+(BI〇-RAD，USA)成像系统记录实验结果。半定量RT-PCR鉴定所用引物如下表1: 其中 0sActin385F及 0sActin385R用于内参基因OsAcinl扩增，而CRLR-RT-F及CRLR-RT-R则 用于CRLR1的扩增。结果CRLR1相比aril突变体表达量高2部以上的株系为增强表达转基因 株系。
[0118] 表1
[0120] 增强表达转基因株系突变体的遗传背景用dCAPS方法鉴定。dCAPS方法分为PCR、酶 切、电泳三步。本实验根据arl1突变体的突变位点设计了PCR引物，序列如下：
[0121] 上游引物：5 'CAAGTTTCTGCGGCACAAGTGCGTCTGC 3'
[0122]下游引物:5'AGATGGGGTCGCGGAGGCGGGCCTG 3'
[0123] 扩增片段大小为 157bp，PCR条件为：95°C5min; 95°C30s，60°C30s，72°C30s，30 个循 环;72°C5min结束。取ΙμLPCR产物做酶切，然后在12%(m/v)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离 DNA片段（120V，2小时）。电泳结束后银染10 - 15min，显色5-10分钟，然后用扫描仪(EPSON PERFECTION4990PHOTO)记录实验结果。结果增强表达株系所得电泳条带和突变体aril- 致(图2C)，表明所得增强表达转基因苗是aril背景的转基因。
[0124] 对增强表达转基因苗进行不定根数目统计结果表明，野生型(SSBM)植株的不定根 数目在不断增长，CRLR1超表达植株的不定根数目自第十天起开始增长，而突变体aril的不 定根数目没有什么变化(图2六，2?)。20天苗龄的不定根表型如图2A所示，超表达植株不定根 数目在7个左右，只有极少数突变体有一个不定根出现，野生型植株的不定根数数目在20左 右。40天苗龄的超表达植株不定根数目都在18个左右，突变体aril只有1-2个不定根，野生 型植株的不定根数目在48个左右。
[0125] 以上结果表明CRLR1的超表达部分恢复了突变体arl1突变体的不定根缺失表型。
[0126] 实施例4、抑制CRLR1基因在水稻中的表达
[0127] RNA干涉载体的构建
[0128] 干涉的构建步骤基本为：
[0129] 通过序列比对查找CRLR基因的特异区域(与水稻其他基因同源性较低的区域)作 为干涉的靶位点，然后设计引物克隆该区域的一段大小为190bp的靶序列(序列SEQIDN0: 1中下划线部分）。克隆靶序列的引物为：
[0130]上游：CATGCCACCAAGCCCGACC
[0131]下游:ACGAGAACGACTTCCCCCACGAC
[0132] 通过PCR克隆该序列，PCR反应条件是94°C变性5min，然后进入循环反应:94°C30s， 58°C30s，72°C30s，循环数为30,最后延伸5min结束。
[0133]将该DNA片段正向序列接上一段内含子序列后再接上一段该DNA序列的反向序列， 然后通过SacI，SalI将这一整段序列连入35S-1300超表达载体(Jiaetal.2011)中，获得 RNAi表达载体。
[0134]具体步骤如下：1 .PCR扩增该DNA片段，将PCR产物与pUCm-T载体(上海生工有限公 司）连接，连接好的质粒分别用PstI，BamHI以及PstI，SalI酶切得到两片段。两片段(正 向，反向）分两步连入pBSSK-in载体中。先用PstI，BamHI酶切pBSSK-in，连上一个片段后， 再NsiI，SalI酶切，连另一片段(PstI与Nsil是同尾酶）。2.用SacI，SalI将两片段以及它们 之间的intron切下，连入35S-1300超表达载体中（图4)。载体构建完成之后转入根癌农杆菌 感受态细胞中。
[0135]利用实施例2所述的方法转化野生型水稻获得一系列RNAi转基因苗，转基因阳性 苗的鉴定同实施例3中的"阳性转基因苗的RT-PCR鉴定"。
[0136] 定量RT-PCR结果表明RNAi转基因苗中CRLR1基因的表达得到一定程度的抑制（图 3B)。表明获得CRLR1基因被抑制的RNAi转基因苗，而对这些RNAi转基因苗的不定根数目统 计结果表明不定根数目减少了约30% (图3A)，表明本发明获得了不定根数目减少的转基因 水稻，不定根数目与CRLR1基因的表达量相关，证明降低CRLR1基因表达能够调节不定根的 数目（图3)。
[0137]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 水稻不定根控制基因CRLR1的用途，其特征是:调控水稻不定根发生能力。2. 根据权利要求1所述的水稻不定根控制基因CRLR1的用途，其特征是：调节水稻的根 系结构，最终提高农作物的产量。3. 根据权利要求1或2所述的水稻不定根控制基因CRLR1的用途，其特征是:水稻不定根 控制基因CRLR1核苷酸序列如SEQIDNO: 1所述或者为在其中添加、取代、插入和缺失一个 或多个核苷酸生成的等位基因和衍生物。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻不定根控制基因CRLR1的用途：调控水稻不定根发生能力，从而调节水稻的根系结构，最终提高农作物的产量。该水稻不定根控制基因CRLR1核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所述或者为在其中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因和衍生物。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105420247
【申请号】CN201510903118
【发明人】毛传澡, 任美燕, 刘绍军, 胡晗, 吴运荣
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月9日