荔枝细胞壁酸性转化酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，更具体地，涉及荔枝细胞壁酸性转化酶基因及其 应用。
【背景技术】
[0002] 蒸枝（LitchichinensisSonn.)是我国重要的南方热带亚热带果树，种植资源十 分丰富，具有很高的食用价值和营养价值，可食部分为假种皮，可食率因为品种的不同而有 着很大的差别。果实中核（即种子）大是影响荔枝果实品质的突出问题之一，荔枝的种胚 败育即"焦核"是荔枝果实发育过程中常见的一种遗传现象，焦核果可食率高，口感也比大 核果好，焦核率是评估荔枝品质的一个非常重要的指标。
[0003]目前栽培的优质荔枝品种如广东的糯米糍、桂味，福建的兰竹、绿荷包，广西的灵 山香荔等，均以焦核为特征。然而，迄今为止学界对荔枝种胚败育的机制研究尚停留在组织 结构观察和生理生化变化的层面上，种胚败育的内在分子机制还没有完全清楚。
[0004] 胚胎发育的任一方面，如花粉、胚囊、胚和胚乳等发育过程受阻都可能引起种子败 育。在荔枝种子的发育过程中，糖分不能在胚乳中正常代谢和积累与其败育有着重要的联 系，现有研究中细胞壁酸性转化酶活性与玉米、蚕豆、大麦、大米以及番茄等植物种类种子 发育呈正相关，缺少细胞壁酸性转化酶的表达降低了玉米和大米种子的贮藏物质储存过 程，番茄细胞壁酸性转化酶抑制物基因沉默后（即增加CWAI活性），番茄种子的尺寸变大。 Wang和Ruan通过对棉花GhCWINl在种子发育早期的时空表达模式研究，发现GhCWINl基因 在胚乳的早期发育阶段（游离核时期）起重要作用。这些研究都说明了细胞壁酸性转化酶 在种子发育过程中有着的重要的作用。申请人通过前期研究发现荔枝的种胚发育与荔枝中 的酸性转化酶相关，但现有技术中还没有克隆出荔枝相关酸性转化酶基因，荔枝种胚研究 机制无法在分子机制层面展开。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供荔枝细胞壁酸 性转化酶基因。
[0006] 本发明的第二个目的是提供上述酸性转化酶基因的应用。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
[0008]荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAIl，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5， 其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1~5所示。
[0009] 所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4， LcCWAI5所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:6~10所示。
[0010] 本发明还提供用于扩增所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2， LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5 的引物，其引物序列如SEQIDNO:11 ~20 所示。
[0011] 本发明还提供含有权利要求1所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI 2,LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5 的表达载体。
[0012] 申请人通过基因沉默表达的方法，对荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1， LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5的功能进行了验证，发现沉默表达荔枝细胞壁酸 性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5能够引起荔枝种胚败 育，从而提尚森枝焦核率。
[0013] 因此，本发明还保护所述基因或所述表达载体在提高荔枝焦核率方面的应用。
[0014] 本发明还保护所述基因或所述表达载体在制备提高荔枝焦核率的制剂方面的应 用。
[0015] 优选地，所述应用是构建LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4 或LcCWAI5 的 沉默表达载体，转化农杆菌获得农杆菌工程菌，以所述农杆菌工程菌作为浸染液浸染荔枝 植株。
[0016] 更优选地，所述农杆菌工程菌的0D6。。为0· 7~1. 4。
[0017] 更优选地，所述荔枝植株为盛花期的植株或花后3周前内结有幼果的植株。
[0018] 优选地，所述荔枝品种为黑叶、白荔、早红、马贵荔等大核品种。
[0019] 优选地，所述浸染荔枝植株的方式为喷洒、浸没、注射。
[0020] 更优选地，对于不同的荔枝品种，所述浸染液的浸染方式有所不同，例如，可以在 荔枝盛花期浸染花穗，也可以通过注射的方式将浸染液注射入荔枝果柄或种柄。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0022] 本发明首次克隆出5荔枝细胞壁酸性转化酶基因，分别命名为LcCWAI1、LcCWAI 2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5,长度分别为 1713bp、1722bp、1734(1758)bp、1677bp和 1740bp，编码的氨基酸数目分别为570、573、577 (585)、558、579个；通过基因沉默技术证 明，沉默所述酸性转化酶基因能够提高荔枝焦核率，在生产上有着广泛的应用前景。
【附图说明】
[0023]图1为部分荔枝组织RNA样品的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1~4为荔枝叶片 样品，泳道5~8为蒸枝种皮样品，泳道9~12为蒸枝种柄样品，泳道13~14为蒸枝花的 样品，泳道15~16为荔枝种仁样品。
[0024] 图2荔枝和其他植株种类CWAI基因进化树分析。
[0025]图3为荔枝LcCWAIs扩增结果；其中，S代表扩增序列（sequence)，Μ代表DNA长 度标记（Marker)。
[0026] 图4为荔枝LcCWAIs在不同品种间的单核苷酸突变，其中，HY:黑叶；NMC:懦米糍； FZX:妃子笑。
[0027] 图5为LcCWAIs氨基酸序列与其他物种的同源性比较。
[0028] 图6为LcCWAIs蛋白的3D结构模型㈧和功能位点预测（B);图6A和图6B按顺 序从左到右依次是LcCWAI1、LcCWAI2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5 编码的蛋白。
[0029] 图7为LcCWAIs不同组织的表达；数据点上的线段为标准误（η= 3)。
[0030] 图8为TRVl(a)和TRV2(b)结构示意图；其中，RdRP为RNA依赖的RNA聚合酶；16K 为富含半胱氨酸的16kDa蛋白；Mp为运动蛋白；Cp为衣壳蛋白；MCS为多克隆位点。
[0031] 图9为不同浓度菌液种柄和果柄注射对"黑叶"和"白荔"种胚发育的影响，其中， ODOO. 7 是 0D6QQ= 0. 7,其它类似。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语 与本领域技术人员熟悉的意义相同。
[0033] 实施例1酸性转化酶基因筛选和克隆
[0034] 一、荔枝样品RNA的提取以及质量检测
[0035] 采用华越洋超快型RNA提取试剂盒（具体方法参照说明书）对"妃子笑"、"黑叶" 和"糯米糍"蒸枝的叶片、花、果皮、果蒂、种皮、种仁等组织的RNA进行提取，RNA的浓度用紫 外核酸蛋白检测仪，取1μ1测定260nm与280nm的比值，若介于1. 80~2. 00之间则可以 进行下一步实验。如果RNA浓度较高，可以稀释一定倍数后检测。
[0036] 琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1，可以看出RNA呈现出清晰的28S和18S两条带， 并且28S的亮度是18S的两倍左右，没有拖尾现象，无DNA污染。表明提取的RNA质量比较 高，无明显降解，满足后续实验的需要。
[0037] 二、细胞壁酸性转化酶基因的筛选和聚类分析
[0038] 根据荔枝基因组测序结果，调出注释为Cellwallinvertase的相关基因（一共 14个），经NCBI比对（与其他物种中相关酸性转化酶基因比对）和生物信息学分析软件分 析，利用MEGA5进行聚类分析后删除同源性较差的个别成员，用生物信息学在线分析网站 Smart工具（http://smart.embl-heidelberg.de/)删除掉一些不具备完整功能或者基因 组注释错误的成员，最后筛选出5个结构完整，与细胞壁酸性转化酶的氨基酸保守功能域 一致的基因LcCWAIs(表1，转化酶基因Genbank分类号见表2)，分别为LcCWAI1、LcCWAI 2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5,对荔枝和5个其他品种已报道的CWAI、SAI和细胞质中 性/碱性转化酶（NI)基因用MEGA5进行聚类分析（图2)，可以看出基因LcCWAIs大致聚 成三类，NI基因聚成一类，液泡酸性转化酶聚成一类，CWAI的5