产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 芽孢杆菌属于厚壁菌门（Firmicutes)，是能形成芽孢（内生孢子）的杆 菌，它们对外界有害因子抵抗力强。目前，研究最多的芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、錯样芽抱杆菌（B.cereus)、苏云金芽抱杆菌（B.thuringiensis)、 炭疽杆菌（B. anthracis)、嗜碱芽孢杆菌（B. alcalophilus)、解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)、地衣芽抱杆菌（B. licheniformis)、短小芽抱杆菌（B.pumilus)、 嗜气芽孢杆菌（B. aerophilus)等。其中，枯草芽孢杆菌（B. subtilis)是一种多功能的微 生物，在饲料工业、污水处理、生物肥发酵和发酵床制作中具有广泛应用。
[0003] 目前临床上治疗血栓的药物，都具有一定的局限性，如毒性强、副作用大、生产成 本高、价格昂贵及体内半衰期比较短等。微生物具有体积小、结构简单、生长繁殖快、代谢旺 盛等特征，如果能找到可以产生具有溶栓活性的代谢物且安全性好的细菌（如枯草芽孢杆 菌），就能开发新一代的溶栓剂或保健食品。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何利用微生物制备具有多种酶活性的物质。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了 一株枯草芽孢杆菌。
[0006] 本发明所提供的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 9754。 该菌种已于2014年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简 称 CGMCC)〇
[0007] 本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754在牛肉膏 蛋白胨培养基上菌落生长迅速。菌落表面初期光滑，后期粗糙不透明，白色至污白色，边缘 初期光滑后变粗糙。菌株细胞大小为（0.7-0. 8) μπιΧ (2-3) μπι，着色均匀。培养24小时以 上大量形成芽孢。无荚膜，周生鞭毛，能运动。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂。
[0009] 本发明所提供的菌剂，它的活性成分是所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) BUABN-01 CGMCC No. 9754 和 / 或所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01CGMCC No. 9754的代谢物。
[0010] 所述菌剂具有下述1)-4)中的至少一种功能：
[0011] 1)具有产溶栓活性（溶解血栓活性）的物质的功能；
[0012] 2)具有产溶纤活性的物质的功能；
[0013] 3)具有产纳豆激酶活性的物质的功能；
[0014] 4)具有产纤维素酶活性的物质的功能。
[0015] 所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可 为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白 碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一 种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、 矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培 养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述 菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
[0016] 根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、稳 定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。
[0017] 所述枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)BUABN_01 CGMCC No. 9754或所述枯草芽 孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754的代谢物，或所述菌剂的下述1)-4) 中至少一种应用：
[0018] 1)在制备具有溶栓活性（溶解血栓活性）的物质中的应用；
[0019] 2)在制备具有溶纤活性的物质中的应用；
[0020] 3)在制备具有纳豆激酶活性的物质中的应用；
[0021] 4)在制备具有纤维素酶活性的物质中的应用。
[0022] 为解决上述技术问题，本发明还提供了培养所述枯草芽孢杆菌（Bacillus 811^1113)81^8^01〇61〇：吣.9754 的方法。
[0023] 本发明所提供的培养所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754 的方法，包括将所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754 在用于培养枯草芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
[0024] 为解决上述技术问题，本发明还提供了制备所述菌剂的方法。
[0025] 本发明所提供的制备所述菌剂的方法，包括将所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN_01 CGMCC No. 9754 和 / 或所述枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis) BUABN-01 CGMCC No. 9754的代谢物作为活性成分，得到所述菌剂的步骤。
[0026] 制备所述菌剂的方法，还可包括在液体培养基中培养所述枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754 的步骤。
[0027] 所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754 的代谢物可 从所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754的发酵液中获得。 所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754的代谢物具体可按照 如下方法制备，在液体培养基中培养所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754,除去液体培养物（发酵液）中的所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) BUABN-01 CGMCC No. 9754 即得到所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) BUABN-01 CGMCC No. 9754的代谢物。
[0028] 上文中，所述液体培养基具体可为发酵培养基。
[0029] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种发酵生产具有下述1)_4)中至少 一种活性的物质的方法，包括在培养基中培养所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) BUABN-01 CGMCC No. 9754,收集发酵液，得到具有下述1)-4)中至少一种活性的物质：
[0030] 1)溶栓活性（溶解血栓活性）；
[0031] 2)溶纤活性；
[0032] 3)纳豆激酶活性；
[0033] 4)纤维素酶活性。
[0034] 上述一种发酵生产具有下述1)_4)中至少一种活性的物质的方法中，所述培养采 用的培养温度可为20-50°C，具体可为30-40°C，进一步的，具体可为35-37 °C ;培养时间为 24-96h，具体可为40-48h，进一步的，具体可为44-48h。
[0035] 上述一种发酵生产具有下述1)-4)中至少一种活性的物质的方法中，所述培养基 含有碳源和氮源。所述碳源可为葡萄糖、麦芽糖或淀粉，具体可为葡萄糖；所述氮源可为酵 母提取物或蛋白胨，具体可为酵母提取物。
[0036] 上述一种发酵生产具有下述1)_4)中至少一种活性的物质的方法中，每升所述培 养基可按照如下方法配制：葡萄糖15g，酵母提取物5g，硫酸镁5g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二 钾2g，氯化钙1. 2g，用水定容至1000mL，将pH值调为7. 0-7. 2。
[0037] 实验证明，本发明的枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No. 9754菌株对人类和环境均无害，使用安全；该菌株能够产生具有溶解血栓活性、纳豆激 酶活性（溶纤活性）和纤维素酶活性的代谢物，是一种能够产具有多种酶活性的枯草芽孢 杆菌。在培