一种糖尿病并发抑郁症的细胞模型及建立方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种糖尿病并发抑郁症的细胞模型及建立方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，并发症多，2013年世界卫生组织调查显示， 全世界约3.47亿糖尿病患者，糖尿病患者抑郁症的发生率为8.5%~71.4%，该比例为非糖 尿病患者的2~3倍，糖尿病并发抑郁症(Diabetes mellitus with depression,DD)患者自 杀危险率高达10%，远高于普通人群的10-30/10万人，因此糖尿病并发抑郁症越来越被人 们所关注，并开始成为严重危害人类健康的疾病之一。
[0003] 但目前尚无一种其体外的细胞模型能够模拟人类DD的临床症状与体征，故极大限 制了 DD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等。
[0004] 现有与糖尿病和/或抑郁症相关的细胞模型的技术介绍如下：
[0005] 1、一种GLP-1受体稳定高表达细胞系的建立及其应用（申请号201210107064.2): 该发明涉及一种糖尿病的细胞模型，建立了一种GLP-1受体稳定高表达细胞系，并提供了一 种筛选预防和/或治疗I型及II型糖尿病的药物的细胞模型。但该发明主要针对胰岛素调控 的细胞模型，不能全面而整体模拟DD的特点，另只是局限于糖尿病单病的细胞模型。
[0006] 2、一种用于筛选抗糖尿病药物的细胞模型（申请号200710203168.2):该发明涉及 一种用于筛选抗糖尿病药物的细胞模型，将分别装载有IR基因的编码序列、STAT5B基因的 编码序列、2~10个串联的STAT5B应答元件DNA序列调控的报告基因编码序列的表达载体共 转染哺乳动物细胞，经稳定筛选后得到上述细胞模型。但该发明主要用于抗糖尿病药物的 筛选，另亦局限于糖尿病单病的细胞模型。
[0007] 关于抑郁症的细胞模型和糖尿病并发抑郁症的细胞模型，迄今暂未见人报道或申 请相关发明专利。因此，本领域急需建立一种糖尿病并发抑郁症的细胞模型，这对于DD的病 理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等，均具有广泛的意义。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的第一个目的是提供一种糖尿病并发 抑郁症细胞模型。
[0009] 本发明的第二个目的是提供上述糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立方法。
[0010] 本发明的第三个目的是提供上述糖尿病并发抑郁症细胞模型在糖尿病并发抑郁 症的病理生理研究或发病机制研究或体外药物筛选或药物评价中的应用。
[0011] 其中，糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立方法为：向培养海马神经元的培养基中 加入葡萄糖和皮质酮，干预培养所述海马神经元18_24h，即得所述细胞模型。
[0012]为了得到良好的细胞模型，所述葡萄糖的加入量优选为50-200mmol/L，所述皮质 酮的加入量为100-400ymol/L。所述葡萄糖的加入量进一步优选为150mmol/L，所述皮质酮 的加入量进一步优选为200ymol/L。
[0013] 本发明所述海马神经元来自受孕大鼠的胎鼠，进一步优选受孕16-18天的SD大鼠 的胎鼠。
[0014] 所述海马神经元优选是在培养基中培养5-7天得到的。
[0015] 本发明所述的海马神经元的分离、培养方法为本领域的常规技术手段，本发明提 供一种改良的海马神经元原代细胞的体外培养方法，所述方法为:取受孕SD大鼠胎鼠的海 马组织，并将所述海马组织机械分离成组织碎块，加入胰蛋白酶和胶原酶进行消化处理；向 消化处理后的体系中加入终止培养基终止酶消化，并进行吹打处理收集上清液，过滤所述 上清液收集细胞滤液，离心所述细胞滤液弃去上清液，重悬，过滤收集滤液，并向所述滤液 中加入接种培养液重悬细胞，调整细胞浓度后接种于细胞培养板，培养3_5h后替换所述接 种培养液为维持培养液培养，培养3-5天后，选择性加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞，继续培养 至5-7天，即得。
[0016] 其中，所述的终止培养基为本领域常规的培养基，本发明优选采用如下的培养基 配方:体积分数89 % DMEM/F12、10 % FBS和1 %双抗。
[0017]所述的接种培养基也为本领域常规的培养基，本发明优选采用如下的培养基配 方:体积分数87%01^1/^12、10%?83、1%1^-谷氨酰胺、1%827和1%双抗。其中，所述?83为 胎牛血清。
[0018] 所述的维持培养基也为本领域常规的培养基，本发明优选采用包含如下组分的培 养基：Neurobasal、B27、Glutamax、双抗，进一步优选采用体积分数为96%Neurobasal、2% 827、1%611^ &111&1、1%双抗的培养基。采用此种培养基的优点是：用611^ &111&1代替传统培养 基中的L-谷氨酰胺，可降低因培养过程中L-谷氨酰胺分解释放毒性胺类物质对神经元造成 的损伤作用。
【附图说明】
[0019] 图1为评价方法1的实验结果。图中:A为正常对照组;B为高糖组;C为皮质酮组;D为 高糖联合皮质酮组。
[0020] 图2为评价方法2的实验结果。图中:A为正常对照组;B为高糖组;C为皮质酮组;D为 高糖联合皮质酮组。
[0021] 图3为评价方法5的实验结果。
[0022]图4为评价方法6的实验结果。图中:A为阴性对照组;B为正常对照组;C为高糖组;D 为皮质酮组;E为高糖联合皮质酮组。
[0023]图5为评价方法6的实验结果。
[0024]图6为评价方法7的实验结果。图中:A为正常对照组;B为高糖组;C为皮质酮组;D为 高糖联合皮质酮组。
[0025]图7为评价方法8的实验结果。图中:A为正常对照组;B为高糖组;C为皮质酮组;D为 高糖联合皮质酮组。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027]实施例1海马神经元原代细胞的体外培养
[0028]实验前日将细胞培养板预先用40mg/ml的L-多聚赖氨酸包被，实验当日吸除培养 板内的多聚赖氨酸，并以PBS轻轻冲洗3次，净化工作台内自然晾干，备用。将受孕18天的SD 大鼠，用10%水合氯醛麻醉，迅速取胎鼠置于大培养皿中，75%乙醇充分消毒，眼科剪快速 取全脑置于含预冷D-Hanks的小培养皿中，充分清洗干净，然后于体视显微镜下用弯头镊小 心向外侧掀开大脑皮质表面，即可见清晰"弓形"海马，左右各一，小心夹取海马并将其从边 缘组织分离。将新剥离的海马迅速投入另一含预冷DMEM/F12的小培养皿中，仔细剔除残留 的脑膜和血管，将海马组织剪成1mm 3左右的组织碎块，然后加入等体积的0.25 %胰蛋白酶 和0.2 %胶原酶，混匀，37°C消化15~20min，每隔5min混匀一次，消化至无明显组织沉淀，加 入终止培养液(体积分数89 % DMEM/F12、10 % FBS和1 %双抗)终止酶消化，轻轻吹打30~50 次，收集上清液，用100目筛网过滤，收集细胞滤液，1200r/min离心5min，弃上清，重悬，200 目筛网过筛，加入接种培养液(体积分数87 % DMEM/F12、10 % FBS、1 % L-谷氨酰胺、1 % B27和 1 %双抗）中重悬细胞，调整细胞密度为3.0 X 105/mL，接种于96孔或24孔细胞培养板中，置 于3 7°(3、5%(：02三气细胞培养箱中培养，411后全量换成维持培养液（体积分数96% Neurobasal、2%B27、l%Glutamax和1%双抗），以后每隔3天半量更换维持培养液。同时于 培养的3~5d后酌情加入终浓度为5μΜ的阿糖胞苷以抑制胶质细胞。并于接种后4h、24h、 5day、8day分别观察海马神经元的基本形态结构，胞体、突起及神经网络情况，备用。
[0029] 为了检验本发明糖尿病并发抑郁症细胞模型的优劣，以下分别通过建立不同模 型，并对所述模型进行评价的方式进行论述。其中所述高糖联合皮质酮组即本发明所述的 糖尿病并发抑郁症细胞模型组。所述终浓度为加入葡萄糖或皮质酮后，葡萄糖或皮质酮在 培养体系中的浓度。
[0030] 评价方法1:形态学观察
[0031] 模型建立:取生长至5-7天的海马神经元，将细胞分为正常对照组、高糖组、皮质酮 组、高糖联合皮质酮组，每组设3个复孔，按以上分组详情加入药物，其中高糖组加入终浓度 为150mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为200μΜ的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓 度为150Μ的葡萄糖和200μΜ的皮质酮，干预24h，然后在倒置光学显微镜下对上述干预条件 下的海马神经元细胞进行一般形态学观察。
[0032] 实验结果显示：正常对照组海马神经元胞体呈类圆形，周围光晕明显，树突丰富， 分叉较多，彼此连接形成丰富的神经元网络；而高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组均呈 现不同程度的细胞胞体裂解破碎，立体感消失，细胞轮廓模糊，细胞碎片较多，神经网络大 部分断裂，且高糖联合皮质酮组细胞损伤更明显(详见图1)
[0033] 评价方法2: HE染色
[0034] 模型建立:取生长至5-7天的海马神经元(预先将其均匀接种在放有14mm圆形盖玻 片的24孔板中），将细胞分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组，每组设3个 复孔，按以上分组详情加入药物，其中高糖组加入终浓度为75mM的葡萄糖，皮质酮组加入终 浓度为1〇〇μΜ的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为75M的葡萄糖和100μΜ的皮质酮， 干预24h。
[0035] HE染色：进行如下操作：①弃掉细胞孔内液体，PBS洗3次；②4 %的多聚甲醛泡 15min后，PBS洗2次，每次lmin;③浸入苏木素染液，染色6min，PBS洗去多余染料;④盐酸酒 精(0.5%)分色2秒，自来水洗2遍;⑤置于0.1%氨水中漂洗，直至肉眼观察玻片为蓝紫色； ⑥伊红染液浸泡30秒，自来水清洗去多余染料;⑦置于空气中干燥，二甲苯透明，中心树胶 封片;⑧倒置显微镜下观察细胞形态。
[0036] 实验结果显示:经HE染色后，镜下观察发现，正常组海马神经元细胞细胞核成卵圆 形，极少数成梭形，且细胞质、细胞核界线分明；葡萄糖组、皮质酮组及葡萄糖联合皮质酮组 均有不同程度损伤，绝大多数细胞核呈梭形，后一组比前两组损伤更严重，近半数海马神经 元细胞的细胞核、细胞质界线模糊。（详见图2)
[0037]评价方法3:葡萄糖消耗量
[0038]模型建立:采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(G0D-P0D)法检测不同干预条件下海马 神经元细胞葡萄糖消耗量，该指标可用于评价受试细胞是否产生胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR)。操作步骤如下:①将分离好的大鼠海马神经元细胞接种至96孔板中，接种 密度为2X10 4个细胞/孔，每孔加入200uL细胞维持培养液(边缘孔用无菌DMEM/F12培养基 填充）；②5 % C02，37°C孵育，至细胞完全贴壁，接种第7d，将细胞分为正常对照组、高糖组、 皮质酮组、高糖联合皮质酮组，按实验分组要求对细胞进行药物干预，其中高糖组加入终浓 度为75mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为100μΜ的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓 度为75Μ的葡萄糖和100μΜ的皮质酮，每组4个复孔；③5%⑶2,37°C分别孵育2h、6h