突变灰盖鬼伞过氧化物酶、制备方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶，同时还涉及该突变灰盖鬼伞过氧化物 酶的制备方法和应用，属于基因工程及环境技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着染织业发展，大量的染料以废水的形式排放进入周围环境，严重破坏了生态 系统，有毒染料废水处理已成为困扰环境保护工作的难题。染织业中的偶氮染料具有复杂 的芳香环结构，对理化因素、热和光稳定，较难被生物降解。目前使用的染料废水处理方法 主要包括物理、化学和生物的方法。理化方法成本较高，并且不破坏染料结构，只是把染料 从一相转移到另一相，会形成新的污染;生物降解工艺具有将染料降解或者转化成二氧化 碳和无机盐的潜能，已经逐渐成为有希望替代现有处理工艺的一种方法，其中酶法降解染 料已逐渐引起了人们的重视。
[0003] 过氧化物酶(EC 1.11.1.7)广泛存在于动物、植物和微生物体内，是一类以铁卟啉 为辅基、过氧化氢为电子受体的氧化还原酶，可氧化多种有机和无机分子，在免疫检测、生 物传感器、工业废水处理方面有着广泛的应用。过氧化物酶家族中研究最多、应用范围最广 的是植物来源的辣根过氧化物(horseradish peroxidase，HRP)。但是，HRP的生产受到地域 和气候的限制，产量低、周期长，使其在工业上的应用受到限制。由墨汁鬼伞菌分泌的灰盖 鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase CIP) -经报道就引起了人们的极大关 注，该酶最先由Shinmen分离纯化得到，由343个氨基酸组成，与Arthromyces ramo sus peroxidase(ARP)在本质上相同。尽管CIP与HRP的同源性不超过10%~16%，但酶学特性和 底物广谱性却十分相似。研究发现，灰盖鬼伞过氧化物酶可以参与清除废水中的酚类物质 和苯类物质，并用作清洁剂、生物传感器等，它能在较宽的pH和温度范围内有效降解刚果 红、甲基橙等偶氮类染料，在纸浆造纸工业极具应用潜力。同时CIP的生产不受地域和气候 限制，是一种有望替代HRP成为有广阔应用前景的工业用酶。
[0004] 灰盖鬼伞属于中温菌，适宜生长在偏酸性环境中，因此产生的CIP在中温和偏酸性 条件下才表现出较高的催化活性，并且CIP对H 202不稳定。但作为工业酶制剂，有关CIP的诸 多应用都要求在中性或碱性条件、高温环境中进行，例如造纸工业中纸浆的生物漂白，洗涤 行业的去污过程等。由于天然CIP的酶学性质致其无法满足工业化应用要求，其产业化应用 受到极大限制。
[0005] 利用分子定向进化技术进行CIP酶学性质的分子改良是提高酶的热稳定性和碱适 应性的重要途径，如Cherry等利用定向进化技术得到了 一个氧化稳定性提高100倍、热稳定 性提高174倍的突变(：1?(1495、￥534、112认、]\1166?』2396、]\12421和￥272?)，但是该突变酶的 高温稳定性较差，40°C处理5min活性下降为87%。目前国际上尚没有关于CIP的最适反应pH 向中、碱性方向偏移，最适反应温度大幅提高且高温稳定性增强的分子定向进化研究，国内 对灰盖鬼伞的研究仅处于菌种发酵生产阶段，对酶的研究甚少。董冰雪等(2014)公开了一 种突变灰盖鬼伞过氧化物酶，由工程菌CIPmt6-2/GSl 15 (是由含6个氨基酸突变的毕赤酵母 密码子偏好性的CIP基因（1493、￥534、112认、]\1166?、￥272?和了280?)连接在表达载体?？1〇2€[ A上，整合于毕赤酵母GS115染色体上构建而成)发酵制备，与野生酶相比，突变酶的最适反 应温度有所提高，最适反应pH向中性方向偏移1.5单位，并且突变CIP用酵母发酵，生产不受 地域、气候限制，周期短、价格低廉，对温度和双氧水的稳定性增强。然而，CIPmt6-2的最适 反应温度仅为32°C，高活性pH范围窄，难以适应工业废水处理中高温反应需要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种最适反应温度45°C、最适反应pH 6.5的突变灰盖鬼伞过 氧化物酶。
[0007] 同时，本发明还提供一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶的制备方法。
[0008] 最后，本发明还提供一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶的应用。
[0009] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 突变灰盖鬼伞过氧化物酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0011] 基因，编码上述突变灰盖鬼伞过氧化物酶，其碱基序列如SEQ ID N0:57所示。
[0012] 重组表达载体，包含上述编码突变灰盖鬼伞过氧化物酶的基因。
[0013] 重组表达基因工程菌，包含上述重组表达载体。
[0014] 突变灰盖鬼伞过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤:取重组表达基因工程菌培 养，诱导表达突变灰盖鬼伞过氧化物酶。
[0015] 所述诱导表达的诱导剂为甲醇。
[0016] 突变灰盖鬼伞过氧化物酶的应用，具体为过氧化物酶在染料废水处理(或降解染 料)中的应用。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明利用基因合成定点突变平台合成CIPmt4,经3轮易错PCR，抗性筛选得到含5 个氨基酸突变(1493、￥534、112^、1166?和￥272?)的灰盖鬼伞过氧化物酶(：1?11^5，其氨基酸 序列如SEQ ID N0:3所示。该突变酶的最适反应温度由野生型的25°C提高到45°C，最适反应 pH由原来的5.0提高到6.5，高活性反应pH变宽，稳定性增强，更适合工业化应用。
[0019] 在选用的偶氮染料氨基黑、甲基橙、刚果红，杂环类染料次甲基蓝、苯胺蓝和三芳 甲烷类染料结晶紫、溴酚蓝共7种染料中，除次甲基蓝外，突变酶对其他6种染料降解的最适 pH均向中性、碱性方向偏移，并且突变酶对7种染料的降解能力均显著高于野生型酶。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例1中采用基因合成定点突变平台合成CIPmt4基因的PCR产物电泳图；
[0021] 图2为突变CIP基因表达载体的构建示意图；
[0022] 图3为CIPmt5和CIPwt蛋白纯化图；
[0023] 图4为以ABTS为底物时CIPmt5和CIPwt的最适反应pH图；
[0024] 图5为以ABTS为底物时CIPmt5和CIPwt对pH的稳定性；
[0025] 图6为以ABTS为底物时CIPmt5和CIPwt的最适反应温度图；
[0026] 图7为以ABTS为底物时CIPmt5和CIPwt对温度的稳定性。
【具体实施方式】
[0027]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0028] 实施例1
[0029] 突变灰盖鬼伞过氧化物酶的分子定向进化，包括：
[0030] l)CIPmt4基因的合成
[0031] 使用DNAworks 3.1软件设计、优化基因拼装的引物，在genebank中查找CIP的DNA 序列(Genebank登录号:X69457)，翻译成氨基酸序列（如SEQ ID N0:1所示），替换序列中第 49、53、166和242位氨基酸，参数选择为：引物长度40bp，毕赤酵母密码子偏好性，重叠区解 链温度60°C，敲除掉内部的Sac I位点，两端加上Sac II和EcoR I限制性酶切位点;输入软 件后得到一系列长40bp左右的寡核苷酸引物，选择重叠区不低于12bp，解链温度相差不超 过2°C，重复、错配最少的50条引物作为基因合成的引物(CIP1~CIP50如SEQ ID N0:4~53 所示）；先将合成好的引物每条配成100μ mol/L，等量混合后用无菌双蒸水稀释至终浓度每 条2ymol/L，配成混合引物；
[0032] 基因合成参照改良的0E-PCR技术，反应分两步，一步基因拼接(gene assembly)获 得完整的模板，一步简单的基因扩增(gene amp 1 ification)得到完整的基因；基因拼接30μ L的PCR反应体系含有混合引物2yL，lXPCR buffer，200ymol/L dNTP，0.3U PrimeSTAR HS DNA聚合酶(反应程序:95°C变性5min; 98°C变性10s，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，30个循 环;72°C延伸5min);基因扩增PCR 30yL反应体系含有第一轮PCR产物1.5yL，20ymol/L引物 CIP1、CIP50各0.5yL，lXPCR buffer，200ymol/L dNTP，0.3U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，反 应参数同基因拼接，PCR产物电泳图见图1 (图中1为DL2000Marker，2为第一轮PCR产物，3为 第二轮PCR产物）；
[0033] 引物CIP1:5' -GCGAATTCCAAGGTCCTGGCGGAGGTGGTAGT-3'，
[0034] 引物CIP50:5 ' -TCCCCGCGGTGGGGCTGGAGCTAAAGAAGGCAGTGGGCC-3 ' ；
[0035] PCR产物纯化后连接到用Sma頂每切处理的pUC19上，电击转化大肠杆菌DH10B，在 含有Amp、IPTG、X-gal的LB固体平板上筛选白色菌落，提质粒送上海invitrogen公司测序， 确认得到含4个氨基酸突变（I49S、V53A、M166F和M242I)的灰盖鬼伞过氧化物酶CIPmt4，其 氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示(碱基序列如SEQIDN0:56所示），质粒命名为CIP4/pUC19。
[0036] 2)易错 PCR
[0037]以CIP4/pUC19质粒为模板，以CIP1、CIP50为引物，采用北京天泽恩基因科技有限 公司的易错PCR试剂盒进行易错PCR扩增(反应程序:95°C预变性5min; 95°C变性45s，56°C退 火30s，72°C延伸lmin，30个循环;72°C延伸5min);三轮易错PCR，每次选择表达的蛋白活性 高且最适pH往中性方向偏移的作为模板进行下一轮易错PCR。
[0038] 3)突变酶文库构建
[0039] 采用天根公司的普通DNA回收试剂盒纯化每轮易错PCR产物，用Sac II和EcoR I双 酶切，酶切产物回收后连接在用同样的酶处理过的酵母表达载体pPICZaA上，命名pPICZaA-cipmt(质粒构建示意图见图2);提取pPICZaA-cipmt质粒，用Sac I线性化处理并回收，根据 毕赤酵母使用操作册制作感受态细胞；向l〇〇yL感受态细胞中加入8yg线性化DNA混匀（5~ 10yg均可），转入电击杯，冰上孵育5min，设置电压1800V，采用eppendorf公司的电击转化仪 器转化毕赤酵母GS115;加入lmol/L的山梨醇，于30°C下静止孵育lh，涂布在含有lOOmg/L Zeocin的YPDS平板上，30°C倒置培养2d(2~3d均可）；挑取转化子，采用载体pPICzaA上的一 对引物A0X5/A0X3(如SEQ ID如:54、55所示）和(：1?基因上最外侧的一对引物(：1?1/(：1?50， 巢式PCR检测CIP基因在毕赤酵母染色体上的整合。<