登革热ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型rt-pcr一步mix检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种登革热I、Π 、m、IV型RT-PCR 一步MIX检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广 泛应用。其基本原理为:在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR 反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强 度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所 示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定 量分析。
[0003] 登革热病毒是小型黄病毒，属于黄热病毒属，能引起登革热急性传染病，通常由在 白天叮咬人的埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，登革热病毒感染人类不仅可引起登革热(Dengue fever，DF)，还可引起登革出血热（Dengue hemorrhagic feverJHF)和登草休克综合症 (Dengue shock syndrome，DSS)，可导致30-40%的患者死亡。登革病毒在血清学上根据E蛋 白抗原性不同分为I、Π 、m、iv型。初次感染产生的型特异性抗体不仅对其他型别的登革病 毒没有交叉免疫保护作用，甚至在异型病毒二次感染时还可能增强病毒的感染，导致更为 严重的DHF/DSS。世界各国曾多次造成大规模暴发性登革热病毒疫情;仅2014年相关统计， 马来西亚登革热病例已累计超六万例；斯里兰卡今年共确诊近三万例；巴西今年共确诊七 万多例，中国广东省三万多例。
[0004] 目前，确诊登革热病毒感染的实验室检测方法通常包括分离登革病毒、检测病毒 的核酸、抗原或抗体或几种检测方法的联合使用。具体的，
[0005] 1.病毒分离:经细胞培养分离病毒，需要生物安全二级(BSL-2)实验室及必要的仪 器设备，在标本运输过程中保持低温(冷冻或冷藏)对于病毒分离非常重要。将标本接种于 蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21、Vero)进行分离培养，出现病变以后，用检测抗原 或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，需要数天，不适于快速诊 断。
[0006] 2.核酸检测：多种逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法可用于登革病毒核酸检测， 包括一步法RT-PCR、实时荧光RT-PCR或套式RT-PCR等方法等。核酸检测可在1-2天内鉴别病 毒RNA。在病人标本中检出病毒核酸，可确诊且能分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因 污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作。阴性结果不能排除登革热诊断，需采集第二份 标本(发病5天后)开展血清学检测，进行确诊。
[0007] 3.抗原检测:NS1抗原检测可采用ELISA方法或快速检测试剂，可在几十分钟到数 小时完成检测，适于现场使用，是登革热急性期诊断的重要手段，在发病后1天即可检出，也 有报道在发病后18天仍可在血标本中检出。目前该方法尚不能分型。由于NS1抗原检测方法 的特异性，也可用于黄病毒感染的鉴别诊断。基于我国登革热流行的特点，国家卫生计生委 颁发的《登革热诊疗指南(2014年第2版)》将标本中检出NS1抗原作为确诊病毒感染依据，可 用于早期诊断。阴性结果不能排除登革热诊断，需采集第二份标本(发病5天后)开展血清学 检测，进彳丁确诊。
[0008] 4. I gM抗体检测：用于I gM抗体检测的捕获法EL ISA (MAC-EL ISA)是最常用的检测 方法，也有多种商业化快检试剂可用于IgM抗体检测，均不能用于血清分型检测。目前检测 试剂主要是检测病毒包膜蛋白特异性抗体，主要缺陷为与其他黄病毒存在交叉反应。标本 中IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不 能确诊。一些登革病毒再次感染者，血标本中IgM抗体滴度底，甚至不能检出，影响IgM抗体 诊断精确性。
[0009] 5. IgG抗体检测：可采用ELISA、免疫荧光（IFA)、免疫层析等方法检测。登革病毒 IgG抗体与其他黄病毒有交叉反应。IgG抗体检测可以用来鉴定首次感染和再次感染，如果 急性期标本IgG抗体阴性，恢复期阳转，则可确定为首次感染;如果患者恢复期血标本IgG抗 体滴度较急性期(两份标本间隔应不少于7天)呈4倍及以上升高可认为是再次感染。采集第 二份标本进行确诊对于登革热防控具有重要意义，尤其是非流行区。
[0010] 6.中和抗体检测：空斑减少中和实验（Plaque Reduction and Neutralization Test，PRNT)和微量中和实验可用来检测血清中的中和抗体，是最特异的血清学检测方法， 可以分型。需要生物安全二级(BSL-2)实验室及必要的仪器设备，耗时长，需要数天，不适于 快速诊断。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。
[0011] 采用上述方法分离到登革病毒可以确诊，然而，其耗时长，需要数天，不适于快速 诊断。登革病毒感染后，潜伏期为3-14天，通常4-7天，潜伏期内采集的患者标本尚不能检出 登革病毒或相应的机体免疫反应，因此潜伏期内无法通过免疫学方法进行早期筛查和疫情 的快速诊断。此外，现有的核酸检测方法存在无法一管多检直接分型，需要使用者按照一定 配方配制反应液。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种登革热I、n、m、IV型RT-PCR-步MIX检测试剂盒，旨 在解决现有登革热检测方法耗时、无法实现早期筛查和快速诊断、且不能一管同时实现登 革热I、π、m、IV型检测的问题。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种登革热I、n、m、IV型RT-PCR-步MIX检测方法。
[0014] 本发明是这样实现的，一种登革热I、Π 、m、IV型RT-PCR-步MIX检测试剂盒，包括 RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包括登革热I、Π 、m、IV型引物和基因探针；
[0015] 所述登革热I、n、m、IV型引物包括：
[0016] 登革热1型上游引物：5'-61'0^^666厶厶1'(：1'1'-3'；
[0017] 登革热1型下游引物:5'-0厶6〇：1'1'111^06〇：-3'；
[0018] 登革热 Π 型上游引物:5 ' -GTYACAAGGAGTGGA-3 ' ；
[0019] 登革热11型下游引物:5'-64661〇^641661'-3'；
[0020] 登革热m型上游引物：5'-GTGCACACAGGAGATC-3' ；
[0021] 登革热111型下游引物：5'-6厶了6(：0^66了611^-3'；
[0022] 登革热1￥型上游引物：5'-60^11^^厶611^66-3'；
[0023] 登革热1￥型下游引物：5'-了六6了0^了六了60^(：-3'；
[0024] 所述基因探针包括：
[0025] 登革热I型基因探针：5'-CAAATTTAGCCGAGAGAGTTCTCG-3' ；
[0026] 登革热 Π 型基因探针：5' -TGTCATCTTCGATCTCTGGATTGT-3' ；
[0027] 登革热111型基因探针：5'-(：1^0^6〇61'1'11^1'1'1^0^0：-3'；
[0028] 登革热1￥型基因探针：5'-06〇：1^〇^7^11^^^1^-3'。
[0029] 一种登革热I、Π 、m、iv型RT-PCR-步MIX检测方法，该方法使用上述登革热I、Π 、 m、IV型RT-PCR-步MIX检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
[0030] 样本RNA提取；
[0031] RT-PCR-步法检测；
[0032] 结果判断；
[0033] 其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
[0034] 50-55〇C：10-15min；
[0035] 92-95〇C：2-3min；
[0036] 92-95°C: 5-10S，55-60°C: 20-40S; 72°C: l_2min; 45循环。
[0037] 本发明提供的登革热I、Π 、m、IV型RT-PCR-步MIX检测试剂盒及其检测方法，运 用登革热病毒（I、Π 、m、IV型)RT-PCR反应液MIX-步法检测试剂盒能同时检测登革热的I 型、π型、m型、IV型，与细胞培养法相比具有快速、灵敏、安全和方便等优点，可应用于登革 热病毒的I型、π型、m型、IV型的早期筛查和环境监控检测。此外，本发明具有操作简单、安 全、快速、灵敏和方便等优点。
【附图说明】
[0038] 图1是实时荧光定量PCR扩增曲线示意图；
[0039] 图2是本发明实施例提供的登革热I、Π 、m、IV型RT-PCR-步MIX检测方法示意图；
[0040] 图3是本发明实施例提供的登革热I、Π 、m、IV型RT-PCR-步MIX检测方法阳性结 果和阴性结果扩增图谱示意图；
[0041 ]图4是本发明实施例1提供的登革热I、Π 、m、IV型RT-PCR-步MIX检测结果扩增图 谱示意图。
【具体实施方式】
[0042] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释 本发明，并不用于限定本发明。
[0043] 本发明实施例中，对下述名词作出如下解释。
[0044] 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR):是体外酶促合成特异DNA片 段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进 行，使目的DNA得以迅速扩增。
[0045] 实时荧光PCR法:是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。
[0046] 逆转录PCR(Reverse Transcr