人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种人副流感病毒I、π、m、iv型 四重pcr检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广 泛应用，其基本原理为:在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR 反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强 度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所 示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定 量分析。
[0003] 人类副流感病毒(HPIVs)常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次 于呼吸道合胞病毒(RSV)。与RSV-样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染 (如感冒和喉咙痛）。它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支气管炎和细支 气管炎），特别是在老年人中和有免疫缺陷人群中。人类副流感病毒是单链的RNA病毒。病毒 表面含有溶合酶和红血球凝聚素-神经氨酸苷酶的醣蛋白。从血清学上人类副流感病毒可 分为4型（I型到IV型），其中IV型又分a和b两个亚型。病毒颗粒大小不一(平均直径大小在 150-300nm之间），形态各异。人类副流感病毒的四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。 其中，I型和Π 型的最典型临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，而I型是这种儿童喉气管 支气管炎的主要原因，Π 型次之，此外，I型和Π 型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾 病；m型经常导致肺炎和细支气管炎;IV型很难检出，可能是因为它很少导致严重的疾病。 人类副流感病毒的潜伏期一般在1-7天左右。
[0004] 人副流感病毒存在于呼吸道分泌物中，通过人与人的直接接触和飞沫经呼吸道传 播。对于成人，HPIV主要侵犯呼吸道黏膜的表层组织，在上皮细胞内增殖，引起的病变较轻， 一般表现为上呼吸道感染(URI)。小于5岁的婴幼儿，病毒常侵犯气管、支气管黏膜上皮细 胞，引起细胞变性、坏死增生和黏膜糜烂。当侵犯肺泡上皮及间质细胞，则引起间质性肺炎 或表现为急性阻塞性喉气管支气管炎和肺炎。HPIV感染可产生局部抗体和血清抗体。人副 流感病毒感染后人的免疫力下降，到目前为止，尚未找到有效的预防与特效治疗方法。
[0005] 婴幼儿呼吸道感染是最常见的感染性疾病，主要由多种病毒引起，据统计大约30-40%的婴幼儿急性呼吸道感染都是副流感病毒引起的。副流感病毒引起的感染症状和流感 病毒相似，仅依靠临床症状及常规的检测方法进行病毒病原的确定并不可靠。因此早期快 速诊断呼吸道病毒感染能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒、抗细菌药物提供依据， 并在避免滥用抗生素方面具有重要意义。目前，检测病毒感染的方法很多，呼吸道病毒感染 病毒学诊断方法主要包括病毒培养、免疫荧光技术、血清学试验、常规分子生物学方法等， 以培养法为金标准。其中，病毒分离培养最为经典，过去常作为金标准，但该方法耗时、耗 力，不能及时指导临床治疗，而且标本内所含病毒数量少可出现假阴性;电镜可检测病毒颗 粒，但操作复杂、昂贵，不适用于临床;病毒核酸检测灵敏度高，但实验条件严格，容易被污 染。病毒特异性抗体检测是临床常见的检测病毒感染的指标，但特异性IgG阳性只能表明有 相应病毒感染，不能用于早期感染判断和疗效监测，IgM类抗体是感染早期或潜伏病毒活化 时产生的，但婴幼儿可因免疫反应较弱而出现假阴性，且病毒特异性抗体检测一次只能检 测一种呼吸道病毒。抗原检测较抗体检测更敏感，是快速而又准确的方法，被广泛引用于 HPIV感染的快速诊断，但结果并不稳定，而且有些HPIV病毒株不容易被特异性单克隆抗体 检测到。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种人副流感病毒I、n、m、IV型四重PCR检测试剂盒，旨 在解决现有技术操作繁琐、准确度不高的问题。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种人副流感病毒I、n、m、IV型四重PCR检测方法。
[0008] 本发明是这样实现的，一种人副流感病毒I、π、m、iv型四重pcr检测试剂盒，包括 PCR反应液，所述PCR反应液包括人副流感病毒特异性引物和基因探针；
[0009] 所述人副流感病毒特异性引物包括：
[0010] 人副流感病毒1上游引物：5'-046了六6〇^64了6了6了6了〇：1'1'(：-3'；
[0011]人副流感病毒I下游引物：
[0012] 5 '-CTTAGGGTTAAAGACAATCCAGYCAAC-3 '；
[0013] 人副流感病毒 Π 上游引物:5 ' -ACCATTTACCTAAGTGATGGAATCA-3 ' ；
[0014] 人副流感病毒 Π 下游引物:5 ' -GATCAGTYGTGGCATAATCTTCT-3 ' ；
[0015] 人副流感病毒111上游引物：5'-0六661^60六11^^1^^1'(^61'(：-3'；
[0016] 人副流感病毒111下游引物:5'-60^6(：1^61'7^〇￥(：1'1'1'-3'；
[0017] 人副流感病毒IV上游引物:5' -CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3' ；
[0018] 人副流感病毒1￥下游引物:5'-厶厶〇厶0^6(：1^61'(：1'(：11^1'-3'；
[0019] 所述人副流感病毒基因探针包括：
[0020] 人副流感病毒I基因探针：
[0021 ] 5 '-CCGTGGARTTRTCATTTCGGGTTGTAGA-3 '；
[0022] 人副流感病毒Π 基因探针：
[0023] 5 '-CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC-3 '；
[0024] 人副流感病毒m基因探针：
[0025] 5，-CCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACCG-3，；
[0026] 人副流感病毒IV基因探针:5'-TAGCAAGACCCATATTATCTGGAACC-3'。
[0027] 以及，一种人副流感病毒I、Π 、m、IV型四重PCR检测方法，该方法使用上述人副流 感病毒I、π、m、IV型四重PCR检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
[0028] 标本处理；
[0029] 实时荧光PCR检测；
[0030] 结果判断，
[0031] 其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
[0032] 50-55〇C：5-10min；
[0033] 94-95〇C：2-3min；
[0034] 94-95°C: 5-10S，55-60°C: 40-80S; 45 个循环。
[0035] 本发明提供的人副流感病毒I、Π 、m、IV型四重PCR检测试剂盒及其检测方法，采 用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从 而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩 增效率低和检测灵敏度低的问题。本发明具有灵敏度高、操作简单、快速、安全等优点，可应 用于人副流感分型的快速检测，早期快速诊断人副流感病毒感染并及时指导临床治疗。此 外，所述试剂盒运用分装技术，比一般的PCR试剂盒节省配制反应液的步骤，更有利用临床 的大量样本检测，省时方便。
【附图说明】
[0036]图1是提供的实时荧光定量PCR扩增曲线示意图；
[0037] 图2是本发明实施例提供的人副流感病毒I、Π 、m、IV型四重PCR检测方法示意图；
[0038] 图3是本发明实施例提供的人副流感病毒I、Π 、m、IV型四重PCR检测方法阳性结 果和阴性结果示意图；
[0039] 图4是本发明实施例提供的人副流感病毒I、n、m、IV型四重PCR检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0040] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释 本发明，并不用于限定本发明。
[0041 ]本发明实施例中，对下述名词作出如下解释。
[0042] 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR):是体外酶促合成特异DNA片 段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进 行，使目的DNA得以迅速扩增。
[0043] 实时荧光PCR法:是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。
[0044] Ct值:每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
[0045] 本发明实施例提供了一种人副流感病毒I、Π 、m、iv型四重PCR检测试剂盒，包括 PCR反应液，所述PCR反应液包括人副流感病毒特异性引物和基因探针；
[0046] 所述人副流感病毒特异性引物包括：
[0047] 人副流感病毒1上游引物：5'-046了46〇^64了6了6了6了〇：1'1'(：-3'；
[0048]人副流感病毒I下游引物：
[0049 ] 5 '-CTTAGGGTTAAAGACAATCCAGYCAAC-3 '；
[0050]人副流感病毒 Π 上游引物:5 ' -ACCATTTACCTAAGTGATGGAATCA-3 ' ；
[0051 ]人副流感病毒 Π 下游引物：5 ' -GATCAGTYGTGGCATAATCTTCT-3 ' ；
[0052] 人副流感病毒111上游引物：5'-04661^60411^^1^^1'(^61'(：-3