用于检测癌前病损的方法
【技术领域】
[00011本发明涉及多配体聚糖-2(syndeCan-2，SDC2)基因作为CpG甲基化生物标记物的 用途，其用于检测癌前病损，所述癌前病损对应于结肠直肠组织的细胞增殖性病症，所述检 测基于特定基因区域中当正常细胞转变成为增生性细胞时发生的异常甲基化事件。更具体 而言，本发明涉及通过测量SDC2基因的特定区域的甲基化程度来早期检测癌前病损的方 法。
【背景技术】
[0002] 即使在医疗科学发达的当今，癌症患者，尤其是占癌症患者大多数的实体瘤患者 (而不是血液癌症患者），其5年生存率低于50%。所有癌症患者的约三分之二被诊断为处于 已进展阶段，并且他们的大多数在癌症诊断后2年内死亡。癌症治疗中的此类不良结局不仅 是由于治疗方法的问题，还由于这样一个事实:在早期诊断癌症和精确诊断进展的癌症和 在癌症治疗后进行癌症患者随访是不容易的。
[0003] 在当前的临床实践中，癌症的诊断是通过如下方法来确诊的：在获取病史、体格检 查和临床评估后进行组织活检，如果疑似癌症的话，然后是放射成像检测和内窥镜检查。然 而，通过现有的临床实践对癌症的诊断，仅仅在癌细胞数目多于十亿个且肿瘤直径大于lcm 时才是可能的。在这种情况下，据报道癌细胞已经具有了转移能力，并且其至少一半已经转 移了。与此同时，用于监测直接或间接产生自癌症的物质的肿瘤标记物被用于癌症治疗后 的癌症监测中，但它们在早期诊断中有局限，这是由于其多达一半甚至在已存在癌症时都 显示为正常，并且它们甚至在不存在癌症时也常常显示为阳性。
[0004] 癌症的早期诊断和治疗困难的原因在于癌细胞与正常细胞显著不同，且高度复杂 和可变。癌细胞大量且连续地生长，侵入周围组织并转移至远端器官，导致死亡。尽管有免 疫机制或抗癌治疗的攻击，癌细胞仍然存活并持续进展，并且选择性地增殖最适于生存的 细胞群。癌细胞是具有高可变度的活体，所述可变性通过大量基因的突变而发生。为了使一 个细胞转变为癌细胞并进展至临床上可检测的恶性肿瘤块，必须发生大量基因的突变。因 此，为了诊断和根治癌症，必须采用基因水平的手段。
[0005] 近年来，人们积极尝试遗传分析来诊断癌症。最简单的典型方法是通过PCR检测血 液中ABL: BCR融合基因的存在（白血病的遗传特征）。该方法的精确度大于95 %，并且在使用 这种简单易行的遗传分析对慢性粒细胞性白血病进行诊断和治疗后，这种方法正在被用于 评估结果和随访研究。然而，这种方法具有缺陷，即其仅能用于一些血液癌症。
[0006] 此外，还尝试了另一种方法，其中通过RT-PCR和印迹法来检测癌细胞表达的基因 的存在，由此诊断血细胞中癌细胞的存在。然而，这种方法的不足之处在于其仅能用于一些 癌症，包括前列腺癌和黑色素瘤，具有高假阳性率。并且，难以对这种方法中的检测和判读 进行标准化，而且其实用性也是有限的（Kopreski，M. S.等，Clin. Cancer Res .，5 :1961， 1999; Miyashiro，I ·等，Cl in · Chem ·，47:505，2001) 〇
[0007] 具体而言，已知癌症患者的癌症组织中的异常细胞通过一些过程(包括凋亡和坏 死)释放出片段化的DNA进入血液流，并因此作为无细胞的肿瘤DNA存在于血液的血清或血 浆中。实际上，已知许多癌症患者的血液流中DNA浓度高于正常人是常见的情况。尝试了使 用癌症特异性异常修饰的DNA区域作为标记物用于诊断癌症(deVos T.等，Clin.Chem.55: 1337-1346 ；Potter N · T ·等，Cl in · Chem · 60 :9 ;Messaoudi S · El ·等，Cl inica Chimica Acta424:222-230;Marzese D.M.等，Expert Rev.Mol.Diagn.13(8):827-844)〇
[0008] 实际上，已经积极尝试了通过检查血清中突变的K-Ras致癌基因、p53肿瘤抑制基 因和pl6基因的启动子甲基化、以及标记和微卫星(microsatellite)的不稳定性，来诊断肺 癌、头颈癌、乳腺癌、结肠癌和肝癌（Chen，X . Q.等，Clin . Cancer Res. ,5:2297,1999; Esteller，M.等，Cancer Res.，59:67，1999;3&11。1162-。68卩6(168，]\1.等，。&11。611^8.，60: 892,2000;Sozzi，G.等，Clin.Cancer Res.，5:2689，1999)〇
[0009] 与此同时，在除血液外的样品中，也能检测癌细胞的DNA。已尝试了通过基因或抗 体检验来检测肺癌患者的痰或支气管肺泡灌洗物中的癌细胞或致癌基因的存在的方法 (Palmisano，W.A.等，Cancer Res ·，60:5954，2000; Sueoka，E·等，Cancer Res ·，59:1404， 1999)。此外，还尝试了另一个在结肠和直肠癌患者的粪便中的粘膜细胞中检测癌细胞衍生 的修饰基因的存在的方法(Ahlquist，D.A.等，Gastroenterol ·，119:1219-27,2000)。然而， 由于在一些癌症患者中发生了这些基因突变，进行精确的癌症早期诊断是受限的。
[0010] 在哺乳动物细胞的基因组DNA中，除A、C、G和T外还存在第五种碱基，即5-甲基胞嘧 啶，其中甲基基团连接于胞嘧啶环的第5号碳（S-mOd-mC总是仅连接至CG二核苷酸的C (5'-mCG-3')，其通常表示为CpGXpG的C主要通过与甲基基团连接而被甲基化。此CpG的甲 基化抑制基因组中的重复序列（如Alu或转座子）的表达。此外，此CpG是哺乳动物细胞中看 起来最常发生表观遗传学变化的位点。此CpG的5-mC天然脱去氨基至T，并且因此哺乳动物 基因组中的CpG仅显示出1 %的频率，其远低于正常频率(1/4X1/4 = 6.25%)。
[0011 ] -些区域中CpG异常整合，此类区域称为CpG岛。术语"CpG岛"指长度为0.2-3kb、且 C+G含量大于50%且CpG比率大于3.75%的位点。人类基因组中约有45,000个CpG岛，大多数 在调控表达基因表达的启动子区中发现。实际上，CpG岛发生在看家基因的启动子中，占约 50%的人基因（Cross，S.等，Curr ·Opin.Gene Develop·，5:309，1995)。已知异常DNA甲基化 主要发生在基因的5'调控区中以减少该基因的表达(Kane M.F.等，Cancer Res.57(5): 808-811)。此处，基因的5'调控区包含启动子区、增强子区和5'非翻译区。近年来，积极进行 了尝试以检查血液、痰、唾液、粪便或尿液中的肿瘤相关基因的启动子甲基化，并将检查的 结果用于诊断和治疗多种癌症（Estel ler，M ·等，Cancer Res. ,59:67,1999; Sanchez-Cespedez，M.等，Cancer Res.，60:892,2000;厶111911181:，0.厶.等，6&81：1'〇61^61'〇1.，119: 1219,2000)。具体而言，众所周知DNA从癌症患者的癌症组织中的异常细胞经过一些过程 (包括凋亡和坏死)释放进入血液，并因而以血液的血清或血浆中的无细胞肿瘤DNA存在，并 且无细胞肿瘤DNA中也存在甲基化DNA片段。这种异常DNA甲基化的存在已被用作标记物用 于诊断癌症（deVos T·等，Clin· Chem. 55 :1337-1346 ;Potter Ν· T ·等，Clin · Chem. 60: 9; Messaoudi S.EI.等，Clinica Chimica Acta424:222_230;Marzese D.M.等，Expert Rev.Mol.Diagn. 13(8) :827-844)。因而，本发明已进行了相关的研究，并已发现多配体聚 糖-2基因的异常甲基化能特异性地用于诊断结肠直肠癌并且在在血清中检测到了这样的 甲基化(KR10-1142131B;0h等 J.Mol. Diag. 15(4): 498-507)。
[0012] 然而，KR 10-1142131B没有公开DNA甲基化用于通过使用无细胞DNA样品来检测癌 前(pre-cancerous)阶段的克隆中的增生性细胞和息肉的用途。
[0013] 已知表观遗传学变异之间基因的特定区域的异常DNA甲基化可能发生在癌前阶 段，并且在一些情况下，特定DNA区域的异常甲基化也可以发生在癌症前(pre-cancer)阶 段，如增生性的细胞、细胞增殖性病症和瘤形成(neoplasia)。
[0014] 因而，本发明已进行了大量工作来开发能够检测细胞增殖性病症的甲基化标记 物，所述细胞增殖性病症对应于癌前阶段中的克隆中的增生性细胞或息肉，并且最终发现 了多配体聚糖-2基因（SDC2;NM_002998)的5'调控区在癌前阶段的结肠直肠组织中是异常 甲基化的，并且更具体而言，用于检测具有癌前病损的人的信息可以通过测量这些患者的 血液中无细胞DNA中的频繁甲基化来提供，由此完成本发明。
[0015]
【背景技术】部分中公开的信息仅用于增加对本发明背景的理解，并因此可以不包含 形成本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
【发明内容】
[0016] 技术问题
[0017] 本发明的主要目标是提供甲基化生物标记物，其能有效用于检测癌前病损(所述 检测癌前病损对应于结肠组织的细胞增殖性病症），以及提供用甲基化生物标记物来早期 检测癌前病损的信息。
[0018] 本发明的另一个目标是提供用于检测SDC2基因的甲基化的方法(所述SDC2基因是 结肠直肠息肉特异性的甲基化标记基因）、SDC2基因用于检测癌前病损的用途、和用于检测 癌前病损的包含SDC2基因的试剂盒及核酸芯片。
[0019] 技术方案
[0020] 为了实现上述目标，本发明提供了在受试者中检测癌前病损的方法，该方法包含 如下步骤：
[0021] (a)从取自所述受试者的生物样品分离基因组DNA;
[0022] (b)测量分离的基因组DNA或其片段中的SDC2(多配体聚糖-2)基因的CpG岛的甲基 化，从而确证癌前病损。
[0023] 本发明还提供在受试者中检测癌前病损的方法，该方法包括如下步骤：
[0024] (a)使分离自取自受试者的生物样品的基因组DNA与至少一个试剂接触，所示试剂 能在基因组DNA的至少一个靶区域内区分甲基化和非甲基化的CpG二核苷酸；
[0025] (b)基于所示接触来确定多配体聚糖-2基因的甲基化状态;和
[0026] (c)确定多配体聚糖-2基因的甲基化与正常对照样品中的情况相比增加，从而检 测受试者中的癌前病损。
[0027]本发明还提供在受试者中检测癌前病损的方法，该方法包括如下步骤：
[0028] (a)从取自受试者的生物样品分离基因组DNA;
[0029] (b)用区分甲基化的DNA和非甲基化的DNA的试剂处理所述分离的基因组DNA或其 片段；
[0030] (c)使经处理的基因组DNA或其经处理的片段与扩增酶和至少一个引物接触，所述 引物包括与至少一个选自下组的序列互补或与其在严格条件下杂交的连续核苷酸序列： SEQ ID NO: 1-5所示的序列，其中所述经处理的基因组DNA或其片段经扩增产生至少一个扩 增产物，或者未被扩增;和
[0031] (d)基于扩增产物的存在或不存在，来确定选自一个或多个选自下组的序列的一 个或多个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平：SEQ ID N0:1-5所示的序列，由此检测癌前病 损。
[0032]本发明还提供用于检测癌前病损的经修饰的核酸，其是来源于如SEQ ID N0:2所 示的SDC2(多配体聚糖-2)基因片段的核酸，并且其通过以下获得:处理SDC2基因片段以将 所述SDC2(多配体聚糖-2)基因片段的至少一个胞嘧啶碱基转换为尿嘧啶或其他可检测出 与胞嘧啶在杂交特性上不相似的碱基。
[0033]本发明还提供用于检测癌前病损的经修饰的核酸，其是来源于如SEQ ID N0:3所 示的SDC2(多配体聚糖-2)基因片段的核酸，并且其通过以下获得:处理SDC2基因片段以将 所述SDC2(多配体聚糖-2)基因片段的至少一个胞嘧啶碱基转换为尿嘧啶或其他可检测出 与胞嘧啶在杂交特性上不相似的碱基。
[0034] 本发明还提供用于检测癌前病损的试剂盒，其含有能够检测SDC2(多配体聚糖-2) 基因的CpG岛的甲基化的物质。
[0035] 本发明还提供用于检测结肠直肠组织癌前病损的核酸芯片，所述核酸芯片具有固 定于其上的探针，所述探针能与SDC2(多配体聚糖-2)基因的含有CpG岛的片段在严格条件 下杂交。
[0036]本发明还提供检测癌前病损的生物标记物，其含有能检测SDC2(多配体聚糖-2)基 因的CpG岛甲基化的物质。
[0037] 本发明还提供了上述生物标记物、经修饰的核酸分子和试剂盒用于检测结肠直肠 组织的癌前病损的用途。
[0038] 附图简述
[0039]图1显示了通过焦磷酸测序测量结肠直肠癌细胞系(HCT116)、正常结肠直肠组织 (正常）、结肠直肠癌患者的癌组织(T)、和与癌组织(T)邻近的正常组织(NT)中SDC2甲基化 生物标记物的甲基化程度的结果。具体而言，图1A是显示每个区域甲基化程度的图，而图1B 是显示每组中启动子(左）、5'UTR(中）和第一内含子(右）甲基化程度的图。
[0040] 图2A显示了测量正常结肠直肠组织(N)和结肠直肠息肉组织(HP和Ad)中SDC2甲基 化生物标记物的甲基化的结果，而图2B显示了为评估生物标记物的诊断能力而进行的R0C 曲线分析的结果。
[0041] 图3A显示了在经结肠镜检查符合正常标准的正常人(N)、结肠直肠息肉患者（息 肉）和结肠直肠癌患者的血清中通过定量甲基化特异性PCR(qMSP)采用组1引物和探针测量 甲基化的结果，而图3B显示了为评估检测结肠直肠息肉的能力而进行的R0C曲线分析的结 果。
[0042]图4A显示了在经结肠镜检查正常的人(N)、结肠直肠息肉患者（息肉）和结肠直肠 癌患者的血清中通过qMSP采用组2引物和探针测量甲基化的结果，而图4B显示了为评估检 测结肠直肠息肉的能力而进行的R0C曲线分析的结果。
[0043]图5A显示了在经结肠镜检查正常的人(N)、结肠直肠息肉患者（息肉）和结肠直肠 癌患者的血清中通过qMSP采用组3引物和探针测量甲基化的结果，而图5B显示了为评估检 测结肠直肠息肉的能力而进行的ROC曲线分析的结果。
[0044]实施发明的最佳方式
[0045]除另有说明外，本文所用的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员 所理解的相同含义。总的来说，本文下文中描述的命名法及实验方法是本领域惯常采用且 熟知的。
[0046]本发明特征在于用多配体聚糖_2(SDC2)基因的CpG岛甲基化(其在结肠直肠息肉 或结肠直肠癌中特异性地甲基化)作为生物标记物。因此，在一个方面，本发明涉及用于检 测癌前病损的生物标记物或组合物，其含有