一种重组人促卵泡生成素的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，属于蛋白质纯化技术领域。
【背景技术】
[0002]卵泡刺激素(促卵泡激素，follicle stimulating hormone，FSH)是由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，具有调节机体的生长、性成熟和繁殖等作用，在生殖过程中起至关重要的作用;可促使男性生精上皮发育、刺激精子发生和精子成熟;对女性的功能为刺激卵泡发育、促使卵泡成熟、促进排卵，可刺激多个卵泡发育、抑制卵巢闭锁、诱导芳香酶活性、刺激颗粒细胞增生及诱导LH和PRL受体产生。
[0003]FSH的糖基结构决定了其生物学活性和生理功能，FSH蛋白的分离纯化不但对结构与功能的研究具有重要学术意义，而且作为一种治疗用生物制品，制备出大量高纯度符合法规要求的纯品，具有重大的经济及社会效益。随着法规要求的不断提高，对重组生产的FSH有了更高的质量要求，如对DNA限度要求的提高，对病毒去除的要求等，所以这对FSH的下游纯化提出了更大的挑战。
[0004]FSH是一种糖蛋白，糖蛋白的不均一性引起理化性质的差异巨大，为层析纯化增加了难度，所以要合理的使用不同原理层析技术，安排好层析顺序，既要考虑质量，还要考虑回收率，同时满足以上两点，才是一个合格的纯化工艺。
[0005]目前纯化重组人FSH的文献中多数采用金属螯合层析或染料亲和层析作为捕获手段，后期通过亲和层析，反相层析，离子交换层析，疏水层析，凝胶层析等多种手段进行后续处理，实现FSH的纯化。专利CN201080056651公开了一种层析方法，次序为反相层析、凝胶层析、疏水层析等，专利CN100554277C中公开了一种层析方法，次序为阴离子交换层析、金属螯合层析、疏水层析等，专利CN101087805中公开了一种层析方法，次序为超滤、阴离子交换层析、染料亲和层析、疏水层析、反相层析、阴离子交换层析等，专利US7939296中公开了一种层析方法，次序为阳离子交换层析、染料亲和层析、疏水层析、凝胶层析等。
[0006]反相层析蛋白质洗脱过程中需要用到有机溶剂，而蛋白质长期暴露在有机环境中可能会引起蛋白质的三级结构改变，丧失生物学活性，金属螯合层析会导致高浓度金属离子引入到蛋白质溶液中，导致蛋白质活性的降低，并增加了后续处理的难度，凝胶层析时间过长，处理量有限。
[0007]随着层析介质制备技术的发展，性能更为优异的层析介质实现商品化，具有更高的载量，更快的速度，更低的吸附，更高的分辨率。应用到生产中将缩短工艺时间，提高处理量，降低成本，提高质量。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术的不足，使用新型层析介质，提供先进的FSH纯化工艺，在工艺和技术上优于已有专利，得到结构更加稳定的蛋白纯品。所采取的技术方案如下:
[0009]本发明的目的在于提供一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，该方法是将重组人促卵泡生成素丰收液依次经过染料亲和层析、疏水层析、脱盐层析、羟基磷灰石层析和阴离子交换层析。
[0010]优选地，所述方法是将重组人促卵泡生成素蛋白的丰收液经过澄清后，上样到染料亲和层析色谱中后收集洗脱液，再将洗脱液依次经过疏水层析、脱盐层析、羟基磷灰石层析和阴离子交换层析后过滤获得重组人促卵泡生成素纯化液。
[0011]所述方法的步骤如下:
[0012]I)澄清重组人促卵泡生成素的丰收液，利用平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡后，将经过澄清的丰收液上样层析，收集并获得亲和层析洗脱液；
[0013]2)利用步骤I)中的洗脱缓冲液平衡输水层析柱，再在将步骤I)所得的亲和层析洗脱液上样层析，收集并获得疏水层析流穿液；
[0014]3)利用平衡缓冲液平衡脱盐层析柱后，再将步骤2)所得的疏水层析流穿液上样到脱盐层析柱中进行脱盐，收集并获得脱盐蛋白液；
[0015]4)利用平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，再将步骤3)所得的脱盐蛋白液进行上样层析，收集并获得羟基磷灰石层析流穿峰；
[0016]5)利用平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡后，将步骤4)所得的羟基磷灰石层析流穿峰进行上样层析，收集并获得洗脱液，再将所得洗脱液经过超滤后获得重组人促卵泡生成素纯化液。
[0017]优选地，所述平衡缓冲液，是pH为6.0-10.5，浓度为5-100mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液。
[0018]更优选地，所述平衡缓冲液的pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液。
[0019]优选地，步骤I)所述亲和层析，所用冲洗缓冲液中所含盐为NaCl，Na2S04，Na3P03，或(NH4)2S04，浓度为150-700mmol/L;所用洗脱缓冲液中所含盐为NaCl，Na2S04，Na3P03，或(NH4)2S04，浓度为 1.2-2.0mmol/L。
[0020]更优选地，所述冲洗缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为400-600mmol/L;所述洗脱缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为1.5-1.7mmol/L。
[0021 ] 优选地，步骤2)所述疏水层析，层析介质为苯基凝胶Phenyl-HP或Capto Phenyl，优选Capto Phenyl ο
[0022]优选地，步骤3)所述脱盐层析，层析介质为G-15或G-25，优选G_25Coarse。
[0023]优选地，步骤4)所述羟基磷灰石层析，层析介质为CHT陶瓷羟基磷灰石或CFT氟代羟基磷灰石介质，更优选地，层析介质为CFT氟代羟基磷灰石介质。
[0024]优选地，步骤5)所述阴离子交换层析，层析介质为含有配基季铵基或二乙胺乙基的Capto-Q，Capto DEAE,Q Sepharose FF,Q Sepharose HP,DEAE Sepharose FF或Capto QimpRes，其中，优选Capto Q impRes;洗脱缓冲液所用盐为NaCl，浓度为70_300mmol/L，优选浓度为80-150mmol/L。
[0025]所述方法的具体步骤如下:
[0026]I)澄清重组人促卵泡生成素的丰收液，利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡后，将经过澄清的丰收液上样层析，层析过程中所用冲洗缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为400-600mmol/L；所述洗脱缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为1.5-1.7mmol/L，收集并获得亲和层析洗脱液；
[0027]2)利用步骤I)中的洗脱缓冲液平衡输水层析柱，再在将步骤I)所得的亲和层析洗脱液上样层析，层析介质为苯基凝胶Capto Phenyl，收集并获得疏水层析流穿液；
[0028]3)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液平衡脱盐层析柱后，再将步骤2)所得的疏水层析流穿液上样到脱盐层析柱中进行脱盐，脱盐层析介质为G-25，收集并获得脱盐蛋白液；
[0029]4)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，再将步骤3)所得的脱盐蛋白液进行上样层析，层析介质为CFT氟代羟基磷灰石介质，收集并获得羟基磷灰石层析流穿峰；
[0030]5)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡后，将步骤4)所得的羟基磷灰石层析流穿峰进行上样层析，层析介质为Capto Q impRes，洗脱液是浓度为80-150mmol/L的NaCl溶液，收集并获得洗脱液，再将所得洗脱液经过超滤后获得重组人促卵泡生成素纯化液。
[0031 ]本发明获得的有益效果如下:
[0032]本发明提供一种适于规模扩大化生产，快速，高效，简便，易于控制的FSH纯化方法，使用新型层析介质，具有工艺简单，成本低，杂质残留少，易于工业化放大生产，目标产物纯度高，收率高等特点，得到产品符合最新的法规要求。
[0033]本发明方法制备的原液经检测电泳纯度100%，液相纯度>99% (SEC HPLC法)，活性>13000IU/mg,氧化亚基含量〈1.5%(反相册1^:法)0嫩残留〈5口8/3348(1^31 time PCR检测)，宿主蛋白残留〈0.01% ο
【附图说明】
[0034]图1为染料亲和层析图谱；
[0035](其中，1.Capto Blue流穿峰 2.Capto Blue预洗峰 3.Capto Blue洗脱峰4.Capto Blue再生峰)。
[0036]图2为疏水层析及脱盐层析图谱；
[0037](其中，1.Capto Phenyl流穿峰2.Capto Phenyl洗脱及再生峰3.G25脱盐峰
4.G25脱盐峰)。
[0038]图3为羟基磷灰石层析图谱；
[0039](其中，1.CFT流穿峰2.CFT清洗峰)。
[0040]图4为阴离子交换层析图谱；
[0041](其中，1.CaptoQ impRes洗脱峰 2.Capto Q impRes清洗峰)。
[0042]图5为染料亲和层析及疏水层析电泳图；
[0043](其中，1.Capto Blue冲洗 2.Capto Blue洗脱 3.Capto Blue拖尾 4.pH灭活后5.CaptoPhenyl流穿 6.PhenyI Capto洗脱 7.marker) 0
[0044]图6为羟基磷灰石层析及阴离子交换层析电泳图；
[0045](其中，CFT流穿2.CFT清洗 3.Capto Q impRes洗脱峰 4.Capto Q impRes清洗峰
5.Capto Q impRes拖尾 6marker)。
[0046]图7为SEC HPLC法FSH液相纯度图谱；
[0047](其中，目标蛋白(峰I)纯度99.94%)。
[0048]图8为反相HPLC法FSH液相图谱；
[0049](其中，氧化亚基含量1.017%)。
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