高活性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物药物领域，具体涉及一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)的突变体，该突变体与野生型TRAIL相比对肿瘤细胞表面的死亡受体DR5具有更高 的亲和力，同时表现出比野生型TRAIL更高的抗肿瘤活性。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-relatedapoptosis-inducingligand, TRAIL)又称为凋亡素2配体(ApoptosisLigand，AP〇-2L)属于肿瘤坏死因子(TNF)家族成 员，它与TNF超家族其它成员一样，属于Π型跨膜蛋白。由于TRAIL可以特异性诱导肿瘤细胞 凋亡，而对正常细胞几乎没有细胞毒性，因此在肿瘤的免疫治疗方面具有广阔的应用前景 (CancerLett2013,332:156-162)〇
[0003] 人TRAIL基因共编码281个氨基酸，其相对分子量为32.5KD，等电点为7.63，为II型 跨膜蛋白，由胞浆区（14个氨基酸），跨膜区（26个氨基酸)和胞膜外区（241个氨基酸)组成。 TRAIL的细胞内区域(胞浆区）没有信号肽序列，TRAIL的细胞外部分降解后可形成可溶性 TRAlUsTRAILhsTRAIL缺少跨膜区和胞内区，N末端无信号肽结构，可溶型分子N端氨基酸 的缺失不影响其生物活性。现有技术下最常使用的两种sTRAIL为TRAIL(95-281)和TRAIL (114-281)，研究表明从95位或114位氨基酸残基开始构建可溶性TRAIL(sTRAIL)克隆，表达 出的蛋白均有活性，并能与特异性受体结合。膜结合型TRAIL(全长TRAIL)和可溶性胞外区 TRAIL即TRAIL(95-281)或TRAIL(114-281)均可与肿瘤细胞表面的特异性受体结合，选择性 地诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞几乎没有毒性。
[0004] TRAIL的受体分为三类，一类为死亡受体（deathreceptor，DR)，包括TRAIL-R1 (DR4)和TRAIL-R2(DR5)，它们含有胞内死亡结构域和依赖Caspase途径的凋亡信号的识别 结构域。TRAIL与DR结合后将TRAIL的死亡信息传递到细胞内，从而激活Caspase系统，最终 引起细胞凋亡。另一类为诱骗受体(decoyreceptor，DcR)，包括TRAIL-R3(DcRl)和TRAIL-R4(DcR2)，它们由于缺乏胞内功能死亡域而不能介导TRAIL诱导的凋亡，故称为诱骗受体。 诱骗受体可竞争性抑制TRAIL与DR4和DR5的结合，起促凋亡拮抗作用。第三类为可溶性受体 OPG(osteoprotegrin)，它虽然可与TRAIL结合并抑制其活性，但正常生理条件下与TRAIL结 合力很低（CurrOpinPharmacol2008,8:433-439)。
[0005] TRAIL与肿瘤细胞膜表面的死亡受体DIM和DR5结合可诱导肿瘤细胞调亡，但同时 TRAIL也可与诱骗受体DcRl，DcR2及0PG结合，而这种结合却不能诱导肿瘤细胞凋亡。因此， 设计和构建对死亡受体DR具有更高亲和力的TRAIL突变体，可以减少与诱骗受体DcR及0PG 的结合，同时提高其诱导肿瘤细胞凋亡的活性。
[0006] 本发明构建了对肿瘤细胞表面死亡受体DR5具有更高亲合力的TRAIL突变体，该突 变体显示出比野生型TRAIL更高的抗肿瘤活性。
【发明内容】
[0007] 由于TRAIL的可溶性胞外区即TRAIL( 114-281)或TRAIL(95-281)与全长TRAIL具有 相同的诱导肿瘤细胞凋亡的活性，本发明的目的在于构建对死亡受体DR5具有更高亲和力 的TRAIL可溶性胞外区的突变体，以提高其抗肿瘤活性。
[0008] 本发明具体技术方案如下： 一种人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体，含有E263G突变，即以人TRAIL全长 氨基酸序列定位，发生突变的位点位于人TRAIL全长氨基酸序列的第263位，氨基酸由Glu突 变为Gly。由于TRAIL的可溶性胞外区与全长TRAIL具有相同的诱导肿瘤细胞凋亡的活性，因 此本发明中所述突变体可以为野生型、衍生型或重组的膜结合型的TRAIL(全长)或含有可 溶性胞外区的TRAIL活性片段。
[0009] 上述含有可溶性胞外区的TRAIL活性片段，优选TRAIL(114-281 )-E263G，氨基酸序 列如SEQIDNo:l所示。或者优选TRAIL(95-281)-E263G，氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0010] 本发明的另一目的在于提供上述突变体在制备治疗或预防细胞凋亡相关疾病药 物中的用途。所述突变体通过与DR5结合后将TRAIL的死亡信息传递到细胞内，从而激活 Caspase系统，最终引起细胞凋亡。所述突变体增强了与DR5的结合力，并提高了其激活 Caspase系统和诱导细胞凋亡的能力。
[0011]进一步的，所述药物可以说是抗肿瘤药物。所述药物含有本发明所述突变体作为 药物活性成分以及药学上可接受的载体。
[0012] 进一步的，所述药物还含有其它抗肿瘤药物和/或抗肿瘤药物增敏剂。
[0013] 本发明所述的突变体可以通过人工合成或基因克隆的方法制备所述突变体的编 码基因，并在相应的宿主细胞中进行表达得到。所述的宿主细胞包括大肠杆菌，酵母，昆虫 细胞或哺乳动物细胞。
[0014] 在本发明的一个实施例中，利用计算机辅助药物设计及活性筛选方法获得了对死 亡受体DR5具有更高亲和力的突变体TRAIL( 114-281 )-E263G(即原第263位Glu突变成Gly)， 该突变体显示出更高的抗肿瘤活性。
[0015] 通过分子克隆的方法，构建出TRAIL(114-281)-E263G突变体的编码基因，并克隆 到含有Tac启动子的原核表达载体pTASH(ProteinExprPurif2002,25:430-436)的EcoRI 和Hindm酶切位点之间，然后将重组质粒转化至宿主菌E.coliJM109中进行胞内表达。工 程菌发酵培养后离心收集菌泥，破壁后离心上清经阳离子交换树脂SP-SepharoseFast Flow柱层析分离纯化，得到纯度达95%以上的样品，经SEC-HPLC分析表明，表达产物以三聚 体形式存在。
[0016] 生物大分子相互作用仪分析显示，突变体TRAIL(114-281 )-E263G与死亡受体DR5 的亲和力(& = 7.73±0.5110-91〇是野生型丁1^几（114-281)与死亡受体01?5的亲和力(& = 1.96±0.2叉10-8]\〇的2.54倍。
[0017] MTT抗肿瘤活性分析显示，对结肠癌细胞C0L0 205，突变体TRAIL( 114-281 )-E263G (IC5Q = 0 · 44nM)的抗肿瘤活性是野生型TRAIL( 114-281) (IC5Q = 2 · 4nM)的5 · 5倍。
[0018]流式细胞仪分析表明，在相同摩尔浓度条件下，突变体TRAIL(114-281)-E263G促 结肠癌细胞C0L0 205的凋亡率显著高于野生型TRAIL( 114-281)。
【附图说明】
[0019] 图1:突变体了1^11^(114-281)12636原核表达载体口了厶-了1^11^12636示意图。 (Ptac:Tac启动子;AP:氨苄抗性基因；TRAIL-E263G:TRAIL( 114-281 )-E263G编码基因；Ori: pUC质粒复制起始点;rrnBTlT2:转录终止子）。
[0020] 图2:突变体TRAIL(114-281)-E263G蛋白表达情况。（箭头所指为目的蛋白所在位 置。M:低分子量蛋白Marker;Lane1:野生型TRAIL(114-281)菌体总蛋白；Lane2:TRAIL (114-281)-E263G菌体总蛋白；Lane3:TRAIL(114-281)菌体破碎上清；Lane4:TRAIL(114-281 )-E263G菌体破碎上清；Lane5 :TRAIL( 114-281)菌体破碎沉淀；Lane6:TRAIL( 114-281 )-E263G菌体破碎沉淀）。
[0021] 图3:10%非还原SDS-PAGE电泳分析突变体TRAIL(114-281)-E263G纯化产物。（M: 低分子量蛋白Marker;Lane1:纯化的野生型TRAIL(114-281);Lane2:纯化的TRAIL(114-281)-E263G)〇
[0022] 图4:SEC-HPLC色谱分析四种标准蛋白。（色谱柱：ShodexPROTEINKW-802.5， SHOWADENK0Κ·Κ·Japan)分析四种标准蛋白：BSA(Mff=67kDa)、鸡卵清蛋白（Mff=43kDa)、 胰凝乳蛋白酶原(MW= 2 5kDa)和溶菌酶(MW= 14.4kDa)。它们的保留时间分别是11.1miη， 11 ·9min，13· 2min，14.lmin，所对应的保留体积分别为7·8ml，8· 3ml，9· 2ml，9·9ml。
[0023] 图5:SEC-HPLC色谱分析纯化的野生型TRAIL( 114-281)。（色谱柱：ShodexPROTEIN KW-802 · 5，SH0WADENK0K·K·，Japan)分析纯化的野生型TRAIL( 114-281)，保留时间为 11 · 618，保留体积为8 ·lml，纯度为96 · 53% )。
[0024] 图6:SEC-HPLC分析纯化的TRAIL(114-281)-E263G突变体。（色谱柱：Shodex PROTEINKW-802.5，SH0WADENK0Κ·Κ·Japan)分析纯化的TRAIL(114-281)-E263G突变体， 保留时间为11.619，保留体积为8.lml，纯度为95.91 %。
[0025] 图7 :MTT法分析野生型TRAIL( 114-281)与TRAIL(114-281 )-E263G突变体对人结肠 癌细胞C0L0 205的促凋亡活性。（野生型TRAIL( 114-281)的IC5Q = 2.4nM;突变体TRAIL( 114-281)-E263G的IC5〇 = 0.44nM)。
[0026] 图8:人结肠癌细胞C0L0 205在不同浓度的野生型TRAIL(114-281)与TRAIL(114-281 )-E263G突变体作用4h后的凋亡率差异。（0.5nM突变体TRAIL(114-281 )-E263G给药组 vs· 0 · 5野生型TRAIL( 114-281)给药组，*P〈0 · 05;InM突变体TRAIL( 114-281 )-E263G给药组 vs·InM野生型TRAIL( 114-281)给药组，#P〈0 · 01