越南槐内生真菌trxy-59-2在防治三七炭疽病中的应用
【技术领域】
[00011本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种越南槐内生真菌TRXY-59-2在防治三七 炭疽病中的应用。
【背景技术】
[0002] 现代农业对植物病害的防治过度依赖于化学农药的使用，大量化学农药的施放不 仅对生态环境具有长期的破坏作用，也引起农产品品质下降，农药残留超标、病原菌的耐药 性以及对人畜有害等诸多问题。寻找更为安全、有效的病害防治方法具有重大的意义，利用 生物的方法来防治植物病害可以有效解决上述问题。
[0003] 三七(PanaxnotoginsengF.H.chen)又名田七、金不换等，具有显著的活血化瘀、 消肿定痛功效，是一种中国传统名贵药材。以三七为主要原料制成的中成药如"云南白药" 和"片仔癀"等广为流传。近年来，对三七原材料的需求日益增长。但是栽培过程中的真菌病 害严重影响了三七生长。目前，在三七种植上，防治真菌病害过度依赖化学农药，大量化学 农药的使用不仅影响了三七的品质，也造成了三七药材的大量农药残留。
[0004]三七炭疽病为三七生长常见病之一，苗期、成株期均可发病，叶片发病初期表现为 叶片生黄褐色斑点，后期病部易穿孔破裂。叶柄和茎感染后会形成黄褐色凹陷斑，果实感染 后变褐色腐烂，该病的病原为Colletotriehumgloeosporioides(简称 C.gloeosporioides)〇
[0005] 这个真菌病害是造成多年来三七产品质量和产量下降的主要原因之一。在广西三 七的传统道地产区，由于低海拔及高温多湿的气象条件，这种病害往往是同时发生的，造成 了三七的大量减产甚至绝收，给种植户带来了巨大的经济损失。为了控制这个真菌病害，大 量的化学农药被使用，造成了三七产品的大量农药残留，严重的污染了环境，大大的威胁了 人们的健康。因此，开展生物防治三七真菌病害对三七产业的可持续发展是非常迫切和必 要的。为此筛选出能同时拮抗这种病害的拮抗菌具有重大意义，筛选进而开发利用拮抗菌 也是有效控制三七真菌病害最具发展潜力的防治措施之一。
[0006] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种越南槐内生真菌TRXY-59-2在防治三七炭疽病中的应 用，从而能有效的防治三七种植过程中出现的三七炭疽病，从而提高三七的产量以及质量。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
[0009] -种越南槐内生真菌TRXY-59-2，越南槐内生真菌TRXY-59-2的分类命名为 Rhexocercosporidiumsp.TRXY-59-2,菌株的ITS序列如SEQIDN0.1 所述，保藏单位：中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏日期:2014年12月03日，保藏号:CGMCCNo.10109。
[0010]优选的是，所述越南槐内生真菌TRXY-59-2代谢产物的制备方法为：
[0011] (1)将越南槐内生真菌TRXY-59-2接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平面皿(PDA平 板）中，置于温度为28°C下培养20天，所得培养材料切成块状并转移到无菌固体培养基中， 置于28°C发酵60天；
[0012] (2)发酵完成后，用发酵物2倍的甲醇浸泡发酵物并超声40min，然后过滤；
[0013] (3)重复步骤（2)两次，合并两次滤液进行减压浓缩成浸膏，得到内生真菌TRXY-59-2 发酵物 的甲醇粗提物 ，即 为越南槐内 生真菌TRXY-59-2 代谢产物。
[0014]优选的是，步骤（1)中所述的无菌固体培养基含400g马铃薯，20g的右旋糖和20g蔗 糖。
[0015]如上述制备所得越南槐内生真菌TRXY-59-2的代谢产物在防治三七炭疽病中的应 用。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0017]本发明首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株内生真菌 (Rhexocercosporidiumsp.)TRXY-59-2,该菌对三七炭疽病菌具有很强的抑制作用，为三 七真菌病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明越南槐内生真菌TRXY-59-2与三七炭疽病的平板对峙培养，其中F为 三七炭疽病菌（0〇1161：〇1：1^6111111181〇6〇8。〇1'；[0丨(168)，3为空白对照，13为实验组 。
[0019]图2是本发明越南槐内生真菌TRXY-59-2菌株形态特征。
[0020]图3为越南槐内生真菌TRXY-59-2菌株基于ITS序列的系统进化树。
[0021]图4是根据本发明菌株越南槐内生真菌TRXY-59-2的代谢产物对三七炭疽病菌的 菌丝生长的抑制效果;其中第1、第5个为空白对照即不含药的PDA平板;第2、第3、第4个为阳 性对照多菌灵粉剂；第6、第7、第8为菌株的代谢产物，且浓度分别为2mg/ml，4mg/ml，8mg/ ml;T为三七炭疽病菌Colletotriehumgloeosporioides。
【具体实施方式】
[0022]下面结合【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体 实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施 例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。甲醇为市购分析纯甲醇。 2XTagMasterMix购自宝生物工程有限公司（Takara)，Primer_l、Primer_2由华大基因合 成。
[0023] 实施例1
[0024]菌株的分离、筛选及鉴定
[0025]一、菌株的分离
[0026]供试材料:采自广西天等县石灰岩地区的野生越南槐。
[0027]供试菌株:由广西大学植物病理研究所提供。
[0028]培养基：1000ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基），Η)Α培养基含马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g和氯霉素0.1g，培养基pH值为6.0 ± 0.2。
[0029] 表面消毒:将长为6-8cm、宽为l-2cm新鲜健康的越南槐根用流水冲洗30min以冲干 净泥沙，然后将洗净的越南槐根用无菌水漂洗2次，风干表面水分，移到超净工作台，在无菌 条件下，将越南槐根用体积浓度为75%乙醇浸泡lmin，无菌水漂洗2次，次氯酸钠(有效氯 1 % )浸泡2min，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干表面备用。
[0030]菌株的分离、纯化:表面消毒好的越南槐根，无菌条件下，用无菌木片刮去表皮，用 无菌枝剪剪去越南槐根的两端，余下部分用无菌小刀和无菌镊子分开木质部和韧皮部，并 用无菌枝剪剪成0.5cm长的组织块，无菌转接至制备好的TOA培养基(含氯霉素），28°C培养。 取最后一次漂洗液涂布在TOA平板上，作为阴性对照。每天观测，待组织周围长出菌丝，挑取 单一菌丝，接于无抗生素的PDA培养基。长出的菌落，如果外部形态不一致，继续挑取单一菌 丝转接PDA培养基，直至平板上新长出的菌落的外部形态一致。
[0031] 将分离到的内生真菌接种于PDA平板内，28°C下培养20天后待用。将三七炭疽病菌 接种于PDA平板，28°C下培养3天后待用。
[0032]二、筛选
[0033]采用平板对峙法对供试越南槐内生真菌进行菌体抑菌活性的初筛。
[0034]首先，无菌条件下，用灭菌打孔器将内生真菌和三七炭疽病菌制成6mm菌饼;在处 理组中，将内生真菌菌饼转接到含TOA的培养皿中央，然后在内生真菌的菌饼周围等径3cm 处放置三七炭疽病菌菌饼，每株内生真菌重复3皿;在对照组中，PDA的培养皿中央不接内生 真菌菌饼，在PDA的培养皿中央周围等径3cm处放置三七炭疽病菌菌饼，重复3皿。然后28°C 下培养，定期观测。待对照组中菌丝长至Η)Α的培养皿平板中央，在处理组中，测量三七炭疽 病菌菌饼中心到内生真菌菌饼中心之间三七炭疽病菌的生长半径为处理生长半径;在对照 组中，测量三七炭疽病菌菌饼中心到PDA的培养皿中心之间三七炭疽病菌的生长半径为对 照生长半径。最后，根据以下公式，计算抑菌率：
[0035]对照生长量=对照生长半径-菌饼半径[0036]处理生长量=处理生长半径-菌饼半径
[0038]结果共得到4株对三七炭疽病菌抑制作用都很强的拮抗越南槐内生真菌菌株，其 中一株名称为了1?￥-59-2，对三七炭疽病菌的抑制率为73%。
[0039]三、鉴定[0040](一)菌株形态特征
[00411菌体形态特征观察:将待鉴定的内生菌真菌菌株TRXY-59-2接种在PDA培养基上， 置于28°C培养，分别在5、14及20天观察其培养特征和颜色变化。取稳定成熟的颜色特征作 为其培养特征，作为鉴定的依据。观察记录气生菌丝的颜色，菌落的大小、颜色、组织形状、 表面形状等作为参考特征。
[0042]孢子形态特征观察:将待鉴定的内生菌真菌菌株TRXY-59-2作插片培养，当在PDA培养基上不产孢子，将菌丝转接于含无菌越南槐根的低营养培养基（四分之一浓度PDA)上 以诱导孢子，将所观察到的形态结果显微照相，如图2所示。
[0043](二)菌株ITS序列及其系统发育学分析[0044]DNA模板的制备：
[0045]试剂：（1)裂解缓冲液：Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTAlmM，SDSl%(w/ v)；
[0046](2)δΜNaCl溶液。
[0047] DNA提取：
[0048]加600yL65°C预热的提取液（Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTAlmM，SDS 1 % )到1.5ml离心管(EP管），用棒刮取少量菌丝放入EP管研磨，65°C水浴30min，离心转速 12000r/min，离心lOmin;
[0049] 取离心所得上清液400yL，加5M NaCL lOOyL，冰浴lOmin;
[0050] 然后在温度为4°C下保持离心转速为12000r/min，离心lOmin，取上清液;加上清液 〇 . 6倍异丙醇与上清液混匀（或2倍无水乙醇）冰浴1h，保持离心转速12000r/miη，离心 lOmin，弃去上清液后所得余下物质晾干，加20yL双蒸水(ddH20)，取l-2yL做DNA模板。
[0051]PCR扩增ITS序列：
[0052] (l)PCR仪:ABI3730-XLDNA测序仪(AppliedBiosystems,USA);
[0053] (2)扩增引物dTSUS'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')如SEQID N0.2 所示，和ITSMS'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')如SEQIDN0.3 所 示；
[0054] (3)扩增体系：
[0055] ITS