抗卵巢癌单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学诊断领域，涉及抗卵巢癌单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是妇女生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌和宫体癌列 居第三位，而病死率却高居首位，且近年来其发病率呈上升趋势，已成为严重威胁妇女生命 的恶性疾病。由于卵巢解剖位置深处盆腔，发病隐匿，早期临床症状和体征不典型，就诊时 约70%的患者已经是晚期，且多已出现转移，致使多数患者失去根治性手术的机会，导致卵 巢癌五年存活率较低，不足30 %。
[0003]糖链抗原125(CA125)是从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体0C125结合的 一种糖蛋白。自1981年首次发现就备受关注，是至今发现最早研究最广泛透彻的卵巢癌肿 瘤标志物，目如是临床上最常用的指标。CA125具有不错的灵敏性，Goonewardene等报道可 高达80%。但是其特异性不太高，因为CA125与胸膜等组织有共同抗原相关，CA125在其他恶 性肿瘤(如子宫内膜癌、宫颈癌，肺癌等)及一些良性疾病中（如肝炎、盆腔炎，胰腺炎等)会 有所升高。此外CA125在卵巢良性疾病甚至在正常卵巢组织中也会升高，同时卵巢癌的临床 病理类型不同，CA125在卵巢癌组织中的表达水平也有不同；在卵巢浆液性囊腺癌中CA125 具有较高表达，在非浆液性卵巢癌例如卵巢粘液性囊腺癌中较低表达。因此其特异性不高 给临床工作者带来不少困惑，对于卵巢癌的诊断还需要发现特异性更高的肿瘤标志物。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体 的杂交瘤细胞株。
[0005]本发明的另一目的是提供抗人卵巢癌单克隆抗体。
[0006]本发明的又一目的是提供该单克隆抗体的应用。
[0007]本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0008] -株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM003-1，于2011年8月31日保藏 于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201174。
[0009] 由所述的保藏号为CCTCCN0:C201174的杂交瘤细胞株NM003-1分泌的抗人卵巢癌 的单克隆抗体NJ003-1。
[0010] 所述的单克隆抗体NJ003-1在制备卵巢癌诊断试剂中的应用;优选在制备卵巢癌 辅助诊断试剂中的应用。
[0011] 所述的辅助诊断试剂优选免疫组织化学检测试剂。
[0012] 单克隆抗体NJ003-1的特异性抗原作为检测靶标在制备卵巢癌诊断试剂中的应 用。
[0013]单克隆抗体NJ003-1在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
[0014]单克隆抗体NJ003-1的特异性抗原作为靶点在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
[0015] 有益效果：
[0016]本发明以人卵巢癌SK-0V-3为免疫原，用杂交瘤技术，筛选到一株能够稳定分泌抗 人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM003-1(CCTCCN0:C201174)。该杂交瘤(CCTCCN0: C201174)所分泌的单抗NJ003-1产量多、效价高，对卵巢癌细胞系有特异性反应，与正常卵 巢细胞、健康人PBMC及其他一些常见的肿瘤细胞系(肺癌、肝癌、乳腺癌及结肠癌)无反应或 低反应性。
[0017] 免疫组织化学结果显示，NJ003-1特异性抗原在卵巢癌组织中的表达高于卵巢良 性疾病组织(85.4 %vs. 3.3 %，p〈0.001)。进一步分析发现:在低分化患者该抗原的阳性表 达率高于中高分化患者(93.3 %vs.67.5 %，p〈0.05);且该抗原的阳性表达率随TOM分期的 升高而升高，ΙΠ~IV期卵巢癌患者组织中的阳性率高于I~Π期组(97.1 %vs. 81.2 %，p〈 0.05);有淋巴结转移的患者其阳性率高于无淋巴结转移者(96.7 %vs.81.0 %，p〈0.05)，差 异均有统计学意义。NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌患者的年龄、肿瘤的大小，组织学 类型无显著关系。可见，NJ003-1的特异性抗原有望成为诊断卵巢癌和预测患者预后的新的 肿瘤标志物，其单克隆抗体NJ003-1在卵巢癌诊断制剂中应用。
[0018] 此外，单克隆抗体NJ003-1能够有效抑制卵巢癌细胞SK-0V-3在软琼脂中的克隆形 成，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。单抗NJ003-1在裸鼠体内能显著抑制人卵 巢癌移植瘤的生长，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。表明单克隆抗体NJ003-1 有望成为治疗卵巢癌的药物。
【附图说明】
[0019] 图1单抗NJ003-1抑制SK-0V-3移植瘤的生长
[0020] 图A肿瘤生长曲线，图B平均肿瘤重量，图C各组切除肿瘤。
[0021] 生物材料保藏信息
[0022] 杂交瘤细胞株匪003-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地 址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCCN0:C201174。
【具体实施方式】
[0023]实施例1杂交瘤的制备
[0024] 1.1动物免疫取6~8周雌性BALB/c小鼠，每只用卵巢癌细胞1~2X106SK-0V-3细 胞/次腹腔注射免疫4次，每次间隔3周。每次免疫前均进行小鼠内眦采血，间接细胞ELISA法 检测小鼠血清抗体效价，待免疫小鼠血清抗体滴度达到最大并不再升高时取鼠脾细胞进行 融合，融合前3d加强免疫1次。
[0025] 1.2间接细胞ELISA试验于96孔板上接种2X105/孔的SK-0V-3细胞(上海拜力生 物科技有限公司），至细胞生长融合达80%，95%乙醇固定，PBS洗3次，0.2%Triton-X-100 通透20min，再用50g/LBSA37°C封闭2h，依次加入不同稀释度的免疫小鼠血清100yL，37°C 温育lh，再经PBS洗3次后，加入1:1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG100yL，37°C温育45min， 经PBS洗涤后，加入TMB显色液，37°C温育10min后终止反应，用酶标仪测定450nm时吸光度 (A)值，以未免疫小鼠血清(1:1000)作为阴性对照。
[0026] 1.3细胞融合取免疫小鼠脾脏研磨制成细胞悬液，与处于对数生长期的骨髓瘤细 胞SP2/0进行融合(姚晓玲，柳晓燕，吴强，等.人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯 化[J].中国免疫学杂志，2006，22(12): 1140-1145 .)，首次融合960孔，融合1周后出现细胞 克隆，有800孔生长杂交瘤细胞，融合率约为83%。按照1.2中的方法进行间接细胞ELISA试 验筛选阳性杂交瘤细胞(将1.2间接细胞ELISA试验中的免疫小鼠血清替换为杂交瘤细胞培 养上清），进行转种和4次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗SK-OV-3单抗且阳性最强的2 株杂交瘤细胞株NM003-1及NM003-2。
[0027]实施例2单抗腹水的制备及纯化
[0028] 取8~10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，10d后分别腹腔注射生长良 好的杂交瘤细胞匪003-1及匪003-2约IX106/只，1~2周后抽吸腹水，37°Clh后，4°C过夜， 次日分别将腹水离心，经ProteinG亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ003-1及 NJ003-2。
[0029]实施例3单抗的鉴定
[0030] 3.1单抗Ig亚类的鉴定：纯化单抗用PBS1:10000稀释，按照测定试剂盒说明书操 作。单抗NJ003-1及NJ003-2的亚类均为IgG，轻链为κ链。
[0031] 3.2单抗效价的测定:分别将纯化的单抗町003-1及町003-2用1^5倍比稀释，分别 取100yL加入包被有SK-0V-3细胞的96孔板中，用间接细胞ELISA法测定A45Q值，能与包被细 胞发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。单克隆抗体NJ003-1效价为8X105,单克隆 抗体NJ003-2效价为4X105。将杂交瘤细胞株匪003-1于2011年8月31日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏地址为武汉，武汉大学，保藏号为CCTCCNO:C201174。
[0032] 3.3染色体鉴定:将对数生长的杂交瘤细胞匪003-1秋水仙碱处理8h，再收集细胞， 经离心甩片在玻片上，用0 . 〇75mo1/LKC1低渗处理，用甲醇冰醋酸固定液固定，经10 %Giemsa染色lOmin,镜下检测染色体。杂交瘤细胞的染色体数目范围为100~106条，因为小 鼠细胞的染色体数目为40条，而SP2/0细胞染色体数目平均为62~68条，证明杂交瘤细胞中 的染色体来自免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，均属杂交瘤细胞染色体核型。 [0033] 3.4单抗特异性的鉴定：用纯化的单抗NJ003-1与6种细胞系及健康人TOMC分别做 间接细胞ELISA分析，观察有无阳性反应。结果显示，单抗NJ003-1仅对卵巢癌细胞抗原具有 较强反应，对其他肿瘤细胞(SPCA-1、HepG2、Co1〇 205、ZR-75-30)抗原、人正常卵巢细胞抗 原及健康人PBMC均无反应。
[0034] 实施例4
[0035] 1.标本来源
[0036]实验标本的组织来源于南京市第一医院和江苏省中医院2013-2015年行卵巢切除 手术的患者（130例卵巢癌，30例卵巢良性疾病）。所有患者经病理检查确诊且术前均未经放 疗、化疗或其他治疗。查找相应的肿瘤组织石蜡标本，所有标本均经10%福尔马林固定和普 通石蜡包埋，由南京市第一医院和江苏省中医院病理科存档并提供。30例卵巢良性疾病包 含15例卵巢良性肿瘤，15例卵巢良性囊肿;在130例卵巢癌患者中，年龄从29岁到80岁，囊括 91例卵巢浆液性囊腺癌、16例卵巢子宫内膜样癌、17例卵巢癌粘液性囊腺癌，6例卵巢透明 细胞癌。按照2004年WHO卵巢癌分类标准对所收集的卵巢癌标本进行分化程度评估，40例中 高分化癌，90例低分化癌。按照2014版AJCC癌症分期手册的标准进行TOM分期，早期（I期~ Π期)96例，晚期（ΙΠ期~IV期)34例；100例无淋巴结转移者，30例有淋巴结转移者，所有纳 入研究的的卵巢癌病人的详细资料见表1。
[0037]表1卵巢癌病人基本资料
[0039] 2.免疫组织化学染色
[0040]免疫组织化学染色具体流程参考韩月，王芳，徐婷，吴蕾等.NJ001-1特异性抗原在 肺腺癌中的表达及临床意义[J].中华检验医学杂志.2013,36(10) :895-898。一抗为单克隆 抗体NJ003-1，以1 %的PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，确诊卵巢癌切片作为阳性对照。 快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物购自福州迈新生物技术开