一种抑制水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种抑制0sRboh(L0C_0s01g25820)基因表达的amiRNA及应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002]活性氧(reactive oxygen species，R0S)是一类生物体有氧代谢的副产物，一方面可以作为有毒的次生代谢物对体内正常分子产生破坏作用；另一方面作为重要的信号分子参与生物体的生长和发。研究发现，R0S的来源包括质膜NADPH氧化酶、过氧化物酶及胺氧化酶，其中由NADPH氧化酶介导产生的R0S最受关注。
[0003]植物NADPH氧化酶又称呼吸爆发氧化酶(Respiratory burst oxidasehomologue，Rboh)，是哺乳动物巨噬细胞NADPH氧化酶催化亚基gp91phox的同源物。目前的研究表明，植物Rboh基因的功能主要集中于两个方面:参与胁迫反应和调控生长发育。本塞姆氏烟草植株(Nicotiana benthamiana)中NbRbohA或NbRbohB基因沉默后，转基因植株的R0S生成量降低，同时，对致病疫霉菌(Phytophthora infestans)的抗性降低，且过敏反应受到抑制。马铃薯中stRbohA参与受伤后超氧根离子02-.的产生，其在马铃薯块茎的伤口愈合及抗微生物感染中起作用番茄反义Rboh植株中R0S的生成量明显下降，同时植株的侧枝增加，花序和花数量为野生型的2-3倍，花瓣多于6瓣，胚珠和花柱的形状变得扁平。大麦HvrRbohA反义转基因植株表现出分蘖变少，育性降低。西瓜CcRboh基因的表达水平在种子萌发后的3 d达到最高，推测其可能在根的发育中起作用。
[0004]microRNA (miRNA)是真核生物细胞内还存在一类长19-21个核苷酸的单链小RNA分子。茎环状premiRNA是miRNA的前体，premiRNA进入细胞后被Dicer酶识别，剪切修饰后得至IJmiRNA^iRNA结构有一段错配序列，这使得miRNA不能与目的mRNA完全互补配对，导致目的mRNA无法被降解。miRNA可以与目的mRNA的3’端UTR结合，以阻碍蛋白翻译的方法达到沉默目的基因的目的。amiRNA即人工合成微RNA(artificial microRNA，amiRNA)，是以生物内源性的miRNA前体分子为骨架，依据体内miRNA的形成过程，采用基因合成的方法合成能够沉默目的基因的微RNA^miRNAi具有特异性高、稳定性强和沉默效果可控等优点，amiRNA可以特异沉默基因家族中的某一个靶基因的表达，而不影响其它成员从而越来越受到人们的关注。
[0005]水稻(Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口都以水稻作为主粮。水稻不仅是一种重要的粮食作物，也是一种重要的模式生物，对相关基因进行功能研究具有重要作用。随着水稻功能基因组研究的不断深入，许多重要农艺性状相关基因相继被分离。Respiratory Burst Oxidase Homolog (Rboh)基因直接参与R0S的形成，但在水稻中的功能并不清楚。鉴于R0S植物生长中的重要作用，获得相应的功能缺失突变体进行研究具有一定的理论和实践意义。尽管目前普通采用RNAi技术具有高效、直接等优点，但其主要的缺点是可同时沉默目的基因家族的其它同源性较高的基因，出现脱靶效应，很难对目的基因进行特异性沉默。因此，采用amiRNA技术针对特异的靶序列可以解决这一难题。本研究利用获得的OSBROH amiRNA序列构建载体水稻，获得的转基因水稻植株叶片变为白色，育性降低，在基础研究和生产实践上具有一定的意义。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种抑制水稻0sRboh(L0C_0s01g25820)基因的amiRNA及用于沉默水稻0sRboh(L0C_0s01g25820)的载体。
[0008]本发明的沉默水稻0sRboh(L0C_0s01g25820)基因的amiRNA，其DNA序列如SEQIDN0.1 所示。
[0009]用于沉默水稻呼吸氧爆发氧化酶0SRboh(L0C_0S01g25820)基因的载体，其特征在于:含有特异性靶向0sRboh(L0C_0s01g25820)基因的amiRNA序列及amiRNA*序列，双35S启动子，潮霉素筛选标记。
[0010]本发明的靶向沉默水稻呼吸氧爆发氧化酶基因0SRboh(L0C_0S01g25820)的载体构建方法，按以下步骤进行:
(1)根据在线软件 httP: //wmd3.weigelworld.0rg 搜寻 0sRboh(L0C_0s01g25820)基因的合适的amiRNA序列，0sRboh(L0C_0s01g25820)的序列特征见SEQ N0 4所示，靶标序列见SEQ IDN0.1 所示。
[0011](2)将amiRNA序列进行反向互补，然后第6位T变为A，第10位的T变为A，获得amiRNA*，其DNA序列如SEQ IDN0.2 所示；
(3)将08肋011(1^0(:_0801825820)的3111丨1?嫩和3111丨1?熟*序列替换08111丨1?528前体中的amiRNA和amiRNA*序列，获得0sRboh(L0C_0s01g25820)-amiRNA序列，其DNA序列如SEQIDN0.3 所示；
(5)将人工合成的0sRboh(L0C_0s01g25820)-amiRNA序列并将其连接至PHB双35S启动子上游，然后转化大肠杆菌DH5a获得目的载体载体PHB-0SRboh(L0C_0S01g25820)-amiRNAl。
[0012]3.本发明的有益效果是干扰载体PHB-0sRboh(L0C_0s01g25820)-amiRNAl转化水稻后能高效靶向水稻目标基因。转基因水稻植株呈现白化苗，植株育性降低，可直接用此做研究材料来探讨0sRbOh(L0C_0s01g25820)基因的功能和作用机理，为在生产实践上更好利用0sRboh(L0C_0s01g25820)基因进行遗传改良奠定基础。
[0013]
【附图说明】
[0014](1)图 1 为PMD18T-0sRboh(L0C_0s01g25820)-amiRNA的BamH I和Xba 頂每切图。
[0015](2)图2为PHB-0sRboh(L0C_0s01g25820)-amiRNA的BamH I和Xba 頂每切图。
[0016](3)图3转基因水稻植株的鉴定图。
[0017](4)图4为苗期转基因水稻植株，其中A为野生型，B为转基因水稻。
[0018](5)图5为成熟期转基因水稻植株，其中A为野生型，B为转基因水稻。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0021]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，CRISPR-Cas9载体BGK03购自杭州百格生物技术公司，其余试剂均为国产分析纯;仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0022]实施例1:水稻OSBROH基因amiRNA序列获得
利用tigr在线数据库查找水稻0SRboh(L0C_0S01g25820)基因并下载。根据在线软件httP://wmd3.weigelworld.0rg搜寻可能的amiRNA序列，并根据反应热动力学参数、有效自由杂交能(A G)和杂交能(Δ Gint)等参数，最后选择“TTAAACAACCGAAGGATACGC”作为目标amiRNA序列。获得候选amiRNA后，将其进行反向互补，第6位T变为A，第10位的T变为A获得amiRNA*ο
[0023]实施例2:水稻PHB-0SBR0H-amiRN