一种基于超亲水微井传感界面检测miRNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于材料制备和检测分析技术领域，涉及在一种新型的传感界面用于miRNA超灵敏检测方法。
【背景技术】
[0002]microRNAs (miRNAs)是一种由19-23个成熟核苷酸组成的小分子非编码RNA，于1993年由Ambros课题组在研究线虫时首次发现，已被证明在生物的生长中起着重要的作用，并在癌症中特异性表达。研究表明，早期检测能有效的提高癌症的治愈率。在早期的癌症检测中，miRNA已成为一种理想的生物标志物。然而由于部分重要的miRNA分子小、丰度低而难以检测，因此敏感的检测miRNA方法的发展是现在迫切需要的。
[0003]基于杂交及扩增原理的检测技术被广泛的应用于核酸的检测中，包括Northernblotting、实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)、微阵列芯片及生物传感器。Northernblotting法是经典的探针杂交检测法，灵敏度不高，且耗时耗量。实时荧光定量PCR将荧光基团加入到PCR反应体系中，利用荧光信号的累积实时监测PCR反应过程，从而对起始模板进行定量分析。但对操作人员专业要求较高、不便于携带且对操作过程中的污染较为敏感。微阵列芯片技术能同时测量多个样品，可以实现miRNA的高通量分析，但容易发生交叉反应，测定结果准确度低。而本发明的一种基于超亲水微井传感界面检测miRNA的方法，可将检测信号增强十几倍，基于超疏水-超亲水微井对样品的富集原理，从而实现miRNA的高效定量超灵敏检测。
【发明内容】
[0004]本发明是一种基于功能化的超亲水微井传感界面，在纳米结构表面构建超疏水-超亲水微井区域，为在其上面的溶液达到浓缩富集的作用，提供一种超灵敏检测的方法，可简单、快速、低成本检测miRNA含量。
[0005]—种基于超亲水微井传感界面上检测miRNA的方法，其特征在于如下步骤:
[0006](1)在透明基片表面附着二氧化硅超亲水微井；
[0007](2)功能化超亲水微井，使其具有生物亲和性；
[0008](3)在功能化的微井中修饰捕获探针，与目标物特异性结合，完成miRNA定量检测。
[0009]具体步骤如下:
[0010]1.制备具有二氧化硅纳米结构的基底:将基片清洗干净并用氮气吹干，水平置于燃烧的蜡烛火焰上方，匀速往返移动，即可得到表面附有均匀的纳米烟灰颗粒的基片。然后放入装有氨水和正硅酸四乙酯的气相沉积反应容器中，室温下反应18-24h，在烟灰表面会包裹一层二氧化硅，经过2h的500-600°C的高温煅烧去除烟灰碳核，得到具有纳米二氧化硅结构的基底。
[0011 ] 2.超亲水微井的形成:先将二氧化硅基底用十八烷基三氯硅烷进行超疏水修饰，然后覆盖具有微孔图案的掩板，用紫外灯照射30-60min，未被掩盖的微孔处的超疏水结构会被紫外破坏而重新恢复超亲水，就得到周围超疏水、微井处超亲水的二氧化硅基底。
[0012]3.功能化超亲水微井:用乙醇作溶剂，加入2 %的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，将具有超亲水微井的二氧化硅基底置于溶液中，6-8h后取出，用乙醇反复清洗并烘干，3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷修饰在超亲水微井中。
[0013]4.检测miRNA:包括一个界面探针和两条与待检测miRNA适配的DNA链，链C( 5 ’〇八八八〇八(^1^丁61^八〇3’)和荧光染料？八1标记的链!1(5?八1-5’(1'10)-GATCTATTGTGTCACACTCCA3，)。在探针DNA链上有一个环状结构，当没有miRNA时，链C和链H不会与探针结合。先将探针DNA链修饰到超亲水微井中，洗去多余的未修饰上的探针DNA，再将链C、链H和miRNA浓度比为1: 1:2的混合液加入到探针DNA修饰的微井中，待反应完成后，洗去多余的未结合的核酸链，用荧光显微镜490nm波长的激发光进行检测。该方法检测miRNA灵敏度高，检测限低，可达到20aM。
[0014]本发明有以下优点:检测敏感度高，miRNA含量低达2ng/100yL时都可以检测出结果，比琼脂糖变性胶检测的精度高出十万倍。检测样品用量少。制备简单，材料易得，检测结果稳走。
【附图说明】
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[0015]图1是本发明提供的纳米二氧化硅基底表面正面扫描电子显微镜图片。
[0016]图2是本发明提供的纳米二氧化硅基底表面侧面扫描电子显微镜图片。
[0017]图3是本发明提供的与普通玻片对比的miRNA含量测定标准曲线图。
【具体实施方式】
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[0018]实施例对本发明作进一步的详细说明
[0019]实施例1
[0020]取普通载玻片，放入洗液(98 %硫酸与30 %过氧化氢溶液，3:1混合)浸泡，80°C加热lh。待玻片冷却后取出再依次放入丙酮、乙醇和去离子水中，室温下超声清洗lOmin，最后用氮气吹净，放入干净的培养皿中备用。将平时用的白色石蜡蜡烛点燃，洗净的载玻片置于蜡烛火焰上方水平匀速移动6s，黑色的烟灰颗粒即可均匀的附着在玻片表面。分别取2mL正硅酸乙酯和2mL氨水放置于密闭容器中，同时放入附着有烟灰的玻片进行气相沉积，室温下反应24h后取出，可得到二氧化硅包裹着的烟灰基底。将样品放入马弗炉550°C煅烧2h，去除烟灰颗粒，得到纳米二氧化硅基底。将二氧化硅基底浸泡在1nM十八烷基三氯硅烷的甲苯溶液中lh，取出后依次用乙醇清洗，烘干后可得到超疏水的二氧化硅基底，掩盖以有微孔的铝板置于10W的紫外灯照射lh，取出铝板后为具有超亲水微井的二氧化硅基底。
[0021]将具有超亲水微井的二氧化硅基底浸泡于加入2%3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，轻晃混合均匀，25°C避光反应6h后取出，依次用乙醇去离子水反复清洗，氮气吹干备用。
[0022]miRNA-122与许多癌症表达相关，在血清中含量范围可达200aM-20pM，需要检测范围很广的检测方法。与其适配的捕获链DNA(HN-(CH2)6-S-S-(CH2)6-5’(T10)CGCGTTAACATACAATAGAT CGCG3’)，微井处滴加2Λ氨基修饰的探针DNA序列