免疫调节祖(imp)细胞的制作方法
【技术领域】
[0001 ]发明涉及免疫调节祖(IMP)细胞及其在治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 中胚层细胞来源于许多组织并且作为其它细胞类型的支持结构。例如骨髓由造血 和间充质来源的细胞构成。之前曾描述并表征过两种主要的间充质细胞类型：即，在骨髓中 发现的（i)间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和它们的前体及（ii)间充质前 体细胞(mesenchymal precursor cel Is，MPCs)。间充质干细胞(MSC)是多能的成年干细胞。 MSC分化形成骨骼组织中发现的不同特化细胞。例如，它们可以分化为软骨细胞(cartilage cell ,chondrocyte)、骨细胞(成骨细胞)和脂肪细胞(脂细胞）。
[0003] MSC被应用于多种治疗，例如治疗年龄相关的黄斑退化(Age-related Macular Degenerati〇n，AMD)和心肌梗塞。一旦给患者施用，MSC通常迀移(或者归巢)至受损组织，并 且通过旁分泌信号和通过促进受损组织中邻近细胞提高的存活、修复和再生发挥其治疗效 果。
[0004] 目前的治疗通常涉及MSC亚型混合物的输注，某些MSC亚型不能有效地迀移至感兴 趣的组织。这使需要使用高细胞剂量，高细胞剂量可引起脱靶副反应和体积相关副反应。 MSC通常从骨髓中获得，所以很难大量获得。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一种之前未被鉴定或分离的新的细胞类型，即，免疫调节祖细胞。这种 IMP细胞非常独特，并且其在组成、功能和特征上与MSC和MPC均不同，被赋予了增强的免疫 调节能力。
[0006] 发明人令人惊讶地鉴定出一种具有特异性标记物表达模式的新免疫调节祖(MP) 细胞。特别是，所述IMP细胞表达MIC A/B、CD304(神经纤维网蛋白1)、CD178(FAS配体）、 CD289(Toll样受体9)、CD363(鞘氨醇-1-磷酸受体1)、0)99、0)181(1型(^-(：趋化因子受体； CXCRl )、表皮生长因子受体(EGF-R )、CXCR2和⑶126，所述标记物在頂P细胞中的表达量明显 高于间充质干细胞细胞(MSC)。本发明的IMP细胞分离自单核细胞(MC)，如外周血MC。所述 MP细胞能够有效移动至受损组织和修复受损组织。特别是，它们能够归巢，粘附，转移，增 殖、具有血管生成作用及发出旁分泌信号。
[0007] 因此，本发明提供一种免疫调节祖（IMP)细胞，其中所述细胞表达可检测水平的 MIC A/B、CD304(神经纤维网蛋白 I)、CD178(FAS配体）、CD289(Toll样受体9)、CD363(鞘氨 醇-1-磷酸受体1)、CD99、CD181(1型C-X-C趋化因子受体 ;CXCR1)、表皮生长因子受体(EGF-R)、CXCR2和CD126。
[0008] 本发明也提供：
[0009] -由两种或更多种本发明的IMP细胞构成的群；
[0010]-免疫调节祖（DIP)细胞群，其中
[0011] (i)群中至少90%细胞表达可检测水平的MIC A/B，
[0012] (i i)群中至少60 %细胞表达可检测水平的⑶304(神经纤维网蛋白I)，
[0013] (iii)群中至少45%细胞表达可检测水平⑶178(FAS配体），
[0014] (iv)群中至少10%细胞表达可检测水平的CD289(Toll样受体9)，
[0015] (V)群中至少15%细胞表达可检测水平的⑶363(鞘氨醇-1-磷酸受体1)，
[0016] (vi)群中至少20%细胞表达可检测水平的⑶99，
[0017] (Vii)群中至少80 %细胞表达可检测水平的CD181(1型C-X-C趋化因子受体； CXCRl)，
[0018] (viii)群中至少30%细胞表达可检测水平的表皮生长因子受体(EGF-R)，
[0019] (Xi)群中至少60%细胞表达可检测水平的CXCR2及
[0020] (X)群中至少5%细胞表达可检测水平的⑶126;
[0021] --种药物组合物，所述组合物包括(a)本发明的IMP细胞或者本发明的群，和(b) 药学上可接受的载体或稀释剂、一种或多种脂质体和/或一种或多种微泡；
[0022]-一种制备本发明頂P细胞群的方法，所述方法包括(a)在诱导MC细胞分化成頂P细 胞的条件下，培养单核细胞(MC)，和(b)收获和培养具有上述表达模式的頂P细胞，从而制备 本发明的群；
[0023] -修复患者的受损组织的方法，所述方法包括:给患者施用本发明的群或者本发明 的药物组合物，其中，所述群或者组合物包含治疗有效数量的细胞，从而治疗患者的受损组 织；
[0024] -本发明的群或者本发明的药物组合物，所述群或组合物在修复患者受损组织的 方法中使用;及
[0025] -本发明的群或者本发明的药物组合物，所述群或组合物治疗患者的心脏、骨、软 骨、肌腱、韧带、肝、肾、肺的损伤或疾病的方法中使用。
【具体实施方式】
[0026] 可以理解的是，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域具体需要而改 变。还可以理解的是，本文所用的术语仅是用于描述本发明的特定实施方式，不是以限制为 目的。
[0027] 另外，在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式的"a"，"an"，和"the"包括复 数指代，除非内容中明确指出不是。所以，例如，涉及"细胞"包括"多个细胞"，涉及"组织"包 括两种或更多种这样的组织，涉及"患者"包括两个或更多个这样的患者，等等。
[0028] 本文引用的所有的出版物、专利和专利申请，不分上、下文，此处通过引用全部并 入本文。
[0029] 本发明的IMP细胞
[0030] 本发明提供免疫调节祖αΜΡ)细胞。頂P细胞表达可检测水平的MIC A/B、⑶304(神 经纤维网蛋白I)、CD178(FAS配体）、CD289(Toll样受体9)、CD363(鞘氨醇-1-磷酸受体1)、 CD99、CD181 (1型C-X-C趋化因子受体;CXCRl )、表皮生长因子受体(EGF-R)、CXCR2和CD126。 [00311 MIC通过减少细胞对NK杀伤的易感性允许细胞及其免疫行为适应炎性环境。
[0032] 0)304(又名为神经纤维网蛋白1)为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的共受体，在血管生成、细胞存活、迀移和侵袭中具有作用。
[0033] ⑶178 (又名FAS配体)维持细胞表型和控制分化。其也具有诱导细胞增殖的能力。 尽管FAS配体被认为主要在凋亡信号传导中，但已显示出具有FAS和FAS配体表达细胞对FAS 诱导的凋亡具有抵抗作用。
[0034] CD289(又名Toll样受体9)参与免疫应答的调节，并可促进细胞向靶组织的迀移。
[0035] CD363(又名鞘氨醇-1-磷酸受体1)的持续激活在体内导致细胞植入成活的增加。 CD363也可促进血管生成，调节细胞归巢，调节细胞的定位和迀移及控制趋化性。
[0036] ⑶99参与细胞粘附和转移。
[0037]有两类白细胞介素-8( interleukin-8，IL-8)受体:CXCRl (或CD181)和CXCR2。与其 它CXC趋化因子相比，两种受体以高亲和力结合IL-8。功能上，CXCRl和CXCR2在增殖、迀移、 侵袭和血管生成中表现出重要作用。受损的组织释放各种可溶性炎性因子，诸如巨噬细胞 迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)和白细胞介素-8,这些因 子可吸引本发明的MP细胞(和其它炎性细胞)通过结合结合的CXCRl和/或CXCR2至受损组 织。
[0038] EGF-R参与细胞迀移、粘附和增殖。
[0039] CD126(又名IL-6R1)增加免疫赦免（immune-privilege) 〇
[0040] 本发明的IMP细胞具有多种优点。此处总结主要优点。但是，其它优点将会从下述 讨论中变得显而易见。
[0041] 本发明的MP细胞可有利地用于修复患者的受损组织。所述MP细胞能够有效迀移 (或者归巢)至受损组织并且在组织中发挥抗炎效果。下面会对此进行更加详细的讨论。所 述MP细胞最重要的能力之一是迀移(或者归巢)至受损位置，其涉及趋化性。其基于趋化因 子信号，并利用诸如旋转、粘附和转移等机制。所述MP细胞的抗炎性作用在受损组织中促 进相邻细胞的存活、修复和再生。细胞也可以发挥旁分泌作用，诸如血管生成因子、趋化因 子、抗凋亡因子的分泌。下面也会对此进行更加详细的讨论。
[0042]如下述详细讨论，所述頂P细胞由单核细胞(MC)产生，如取自如人类个体等个体的 外周血MC。因为所述MP细胞由MC产生，它们可容易制备(如从外周血制备)并且对给所要治 疗的患者是自体的从而避免患者免疫排斥的风险。
[0043]因为可获得多种MC样本(即多种血液样本），理论上可以从单个个体制备无限数量 的IMP细胞。从单个个体中制备非常大量的IMP细胞确实是可能的。因此本发明的IMP细胞可 以大量制备。
[0044] 本发明的IMP细胞在临床相关条件下制备，例如不存在痕量内毒素和其它环境污 染物，以及动物产物例如胎牛血清。其使得本发明的MP细胞特别适合对患者施用。
[0045] 因为本发明的IMP细胞由MC产生，它们基本上是同质的，并且可能是自体的。它们 也避免供体-供体变异，这种变异经常在MSC上发生。在如化疗和放疗等任何其它治疗开始 前，可以从获自患者的单个样本中制备大量的本发明的IMP细胞群。因此，本发明的頂P细胞 可以避免那些治疗的任何不利影响。
[0046]本发明的頂P细胞可以被快速制备。頂P细胞可以在少于30天内（诸如在约22天内） 从MC获得。
[0047] 来自MC的IMP细胞制备避免了涉及使用来源于人类胚胎干细胞(human embryonic stem cel Is，hESCs)的间充质干细胞MSC的道德和伦理问题。
[0048]本发明的MP细胞主要由人类MC制备。因此本发明的MP细胞通常是人细胞。作为 另选，MP细胞可从其它动物或者哺乳动物中产生，例如来自商业养殖的动物，如马、牛、绵 羊或猪;来自实验室动物，如小鼠或大鼠；或者来自宠物，如猫、狗、兔或者豚鼠。
[0049]本发明的IMP细胞可以使用本领域已知的标准方法被鉴定为免疫调节祖细胞，所 述方法包括表达谱系限制标记、结构和功能特性。所述IMP细胞将表达可检测水平的被认为 頂P是特征的细胞表面标记物。其在下文中讨论。
[0050]本发明的IMP细胞可以成功完成体外分化试验以确定其是中胚层谱系的。所述试 验包括但不限于成脂分化试验，成骨分化试验和神经源性分化试验（ZaimM等 AnnHematol .2012年8月；第91 卷第8期：1175-86页）。
[0051 ]本发明的MP细胞不是干细胞。特别是，它们不是MSC。它们是终末分化的。尽管它 们可以在正确的条件下在体外被迫分化，例如分化成软骨或骨细胞，在体内它们通常不分 化。本发明的MP细胞通过迀移至受损组织并且在受损组织发出旁分泌信号而发挥作用。特 别是，MP细胞优选可以在受损组织诱导抗炎性作用。下面会进行更加详细的讨论。
[0052] 本发明的IMP细胞以梭形形态为典型特征。頂P细胞典型为成纤维细胞样的，即它 们具有小细胞体和长而细的少量细胞突。通常细胞直径在约10至约20μπι。
[0053] 本发明的IMP细胞与包括MSC在内的已知细胞不同之处在于它们的标记物表达模 式。IMP表达可检测水平的MIC A/B、CD304(神经纤维网蛋白1)、CD178(FAS配体）、CD289 (1'〇11样受体9)、00363(鞘氨醇-1-磷酸受体1)、0099、0)181(1型^-(：趋化因子受体 ； CXCR1)、表皮生长因子受体(EGF-R)、CXCR2和CD126。与MSC相比，頂P优选表达增加量的所述 标记物。这可以通过在相同的条件下使用相同的技术，比较本发明的MP中标记物的表达水 平/量和MSC中的表达水平/量来进行确定。适合的MSC是商业可得的。用于比较的MSC优选为 人类MSC。人类MSC可商业获得自 Mesoblast?Ltd，Osiris Therapeulics'?Inc或 Lonza?.。人类 MSC优选获自Lonza?。这样的细胞用于在实施例中进行比较。MSC可能来源于以上讨论的任 何动物或者哺乳动物。
[0054] 与MSC比较，頂P细胞优选表达增加量的MIC A/B、CD304(神经纤维网蛋白I)、CD 178 (FAS 配体）、CD289(Toll 样受体 9)、CD363(鞘氨醇-1-磷酸受体1)、〇)99丄0181(1型(^-(：趋 化因子受体;CXCRl )、表皮生长因子受体(EGF-R)、CXCR2和CD126中的一种或多种。与MSC比 较，IMP细胞优选表达增加量的所有10种标记物。
[0055] 本领域已知的标准方法可以被用于确定以上（和以下）讨论的多种标记物的可检 测的表达或者增加的表达。合适的方法包括但不限于免疫组化，免疫分析、流式细胞术如荧 光激活细胞分选术(FACS)，聚合酶链式反应(PCR)如反转录PCR(RT-PCR)。适合的免疫分析 包括但不限于Western印迹法、酶联免疫测定法(ELISA)、酶联免疫吸附斑点试验(ELISP0T 检测）、酶放大免疫分析技术、放射过敏原吸附试验(RAST )、放射免疫测定、放射结合试验和 免疫荧光。Western印迹法，ELISA和RT-PCR全部为定量的，并且因此可以用于测量的多种标 记物(如果标记物存在)的表达。高通量的FACS(HT-FACS)的使用在实施例中公开。此处公开 的任何一种标记物表达或增加的表达优选使用HT-FACS进行。此处讨论的所有各种标记物 的抗体和荧光标记的抗体是商业可得的。
[0056] 优选，本发明的IMP细胞显示出：MIC A/B的抗体平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI)为至少330，例如至少350或至少400，CD304(神经纤维网蛋 白1)的MFI为至少210,如至少250或至少300，CD178(FAS配体）的MFI为至少221，如至少250 或至少300，CD289(T〇11样受体9)的MFI为至少186,如至少200或至少250，CD363(鞘氨醇-1-磷酸受体1)的MFI为至少181，如至少200或至少250，CD99的MFI为至少184，如至少200或至 少250，CD181 (1型C-X-C趋化因子受体;CXCRl)的MFI为至少300，如至少350或至少400，表皮 生长因子受体(EGF-R)的MFI为至少173，如至少200或至少250，CXCR2的MFI为至少236，如至 少250或至少300，CD126的MFI为至少160,如至少200或至少250。平均荧光强度(MFI)是以 瓦/平方米为单位测量的强度-时间平均能量通量的度量。其为SI单位。每个标记物的MFI通 常使用HT-FACS测量。如实施例所述，每个标记物的MFI优选使用HT-FACS测量。
[0057] 除了以上特别指出的10种标记物，本发明的MP细胞在实施例中通常表达可检测 水平的表1中所显示的一种或更多种其它标记物。MP细胞可表达可检测水平的任何数量和 组合的所述标记物。
[0058] 頂 P 细胞优选表达可检测水平的 CD267、CD47、CD51/CD61、CD49f、CD49d、CD146、 CD340、Notch2、CD49b、CD63、CD58、CD44、CD49c、CD105、CD166、HLA-ABC、CD13、CD29、CD49e、 〇073、0)81、0090、0)98、00147、0)151和0)276中的一种或多种。頂?细胞更优选表达可检测 水平的 CD10、CDlll、CD267、CD47、CD273、CD51/CD61、CD49f、CD49d、CD146、CD55、CD340、 0)91^(^(^2、0)1758、0082、0)4%、0)95、0063、0)245、0)58、00108、82-微球蛋白、00155、 CD298、CD44、CD49c、CD105、CD166、CD230、HLA-ABC、CD13、CD29、CD49e、CD59、CD73、CD81、 0090、0)98工0147、00151和0)276中的一种或更多。頂?细胞可表达可检测水平的任何数量 和组合的所述标记物。頂P细胞优选表达可检测水平的全部所述标记物。
[0059] 1]^细胞优选表达可检测水平的0015613,0061，0020213,00130,00148,00288， CD337，SSEA-4，CD349和CDHOb中的一种或多种。頂P细胞更优选表达可检测水平的CD156b、 CD61、CD202b、CD130、CD148、CD288、CD337、SSEA-4、CD349、CD140b、CD10、CDlll、CD267、 CD47、CD273、CD51/CD61、CD49f、CD49d、CD146、CD55、CD340、CD91、Notch2、CD175s、CD82、 0)4%、0)95、〇063