用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法和装置的制造方法
【专利说明】
【背景技术】
[0001]本发明涉及用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法和用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的装置。本发明尤其涉及例如用于所谓的芯片实验室或口袋实验室(Lab-On-A-Chip)的微流体体系Ο
[0002]在分子诊断中，经常需要检测样品中的病原体DNA或RNA。将由病原体，例如病毒或微生物，例如细菌或真菌获得的DNA或RNA称为病原体DNA或RNA。将样品尤其理解为是指血液样品，但原则上也可以是指其它液体或液化的患者样品，例如，尿、粪便、痰、脑脊液、灌洗液(Lavage )、冲洗过的抹片或液化的组织样品，特别是当它们包含血液或血液痕迹时。与此相关的病征例如是尿路感染和败血症。在疑似尿路感染的情况中应从尿中检测病原体。在这种情况下，病原体的浓度可能非常小，例如103至107每毫升。在疑似败血症的情况中，例如令人感兴趣的是，由血液检测病原体以及任选测定对某些抗生素的耐受性。由于病原体和白血球之间的浓度比，例如10-1000/ml对106-107/ml，在这种情况中，在样品中有很强的人DNA背景。商购可得的例如由血液中选择性提纯病原体的方法使用例如化学试剂，以首先选择性裂解人细胞。随后，酶促消化人核酸。然后例如通过离心分离和滗析上清液分离病原体。这种方法例如公开在DE102005009479A1中。
[0003]US 2010/0285578 A1公开了由生物样品制备核酸的装置和方法。
【发明内容】
[0004]在此背景下，根据独立权利要求提供用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的改进的方法和用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的改进的装置。由各自的从属权利要求和下文中的描述得到有利的实施方案。
[0005]根据本发明的实施方式可以实现尤其用于由也包含非病原体核酸的样品例如由血液细胞选择性制备病原体核酸的生物样品的处理，和/或实现由样品积聚病原体并随后将其裂解。本发明的实施方式在这种情况下包括例如用于热预处理样品的方案和/或借助过滤器以及超声波用于样品处理的方案。因此，选择性裂解伴随细胞的热预处理与酶促消化和借助过滤分离的组合尤其具有这样的目的，即由也包含伴随细胞的样品获得提纯的靶细胞-核酸。例如也提供借助超声波在过滤器上进行生物颗粒的裂解，由此可通过超声波破坏过滤器的复合材料，以及微流体体系。
[0006]具体地，本发明的实施方式可有利地用于在分子诊断中例如用于诊断感染性疾病的体系或实验室例行程序中，或者用于分子诊断中的微流体芯片实验室体系。
[0007]本发明的实施方式可以有利地将含于样品中的靶细胞-核酸，例如病原体DNA，从伴随细胞-核酸，例如人DNA的背景中可靠地分离出来。由此避免伴随细胞核酸干扰随后的扩增-和检测步骤，并因此改善了检测和/或诊断的敏感性。在热预处理样品时可通过尤其是酶促消化可靠地避免例如在温度过高和/或预处理持续时间过长时会出现的样品胶凝化。在此，样品的胶凝也可以考虑与胶凝相关的临界温度和持续时间取决于样品的性质例如红细胞比容来避免。通过例如酶促消化可以避免样品堵塞过滤器。由此甚至可以处理大的样品量。在此情况下，过滤能由相对大的血液体积，例如1-10毫升，积聚仅少量的病原体，例如10-1000个。由此，可以提高靶细胞-核酸的有效浓度并使随后的扩增和检测变得容易或者可提高灵敏度。本发明的实施方式特别好地适用于自动化，特别是在微流体体系中。在这种情况下可容易地施行并且减少污染的风险。
[0008]因此，本发明的实施方式能够实现由样品积聚靶细胞并由此提高后续的扩增-和/或检测步骤的效率。在此也可以以有利的方式尤其利用超声波来裂解积聚在过滤器上的靶细胞，由此可导致特别有效的分解。与例如离心分离相反，借助过滤器积聚靶细胞特别好地适合于自动化进行，例如在微流体体系中。这样的自动化进行的优点在于，需要较少的手动操作步骤并减少了污染和/或操作者失误的风险。在将本发明的实施方式转移到微流体体系中时，可在积聚过程中非常精确地控制流速。由此可避免堵塞过滤器或者无意地将靶细胞通过过滤器冲走。
[0009]处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法具有下列步骤:
通过从样品中分离靶细胞或伴随细胞来积聚样品的靶细胞；
通过化学和/或物理裂解来分解靶细胞，以制备含有靶细胞-核酸的靶细胞裂解液;和由靶细胞-裂解液提纯核酸，以提取靶细胞的核酸。
[0010]所述靶细胞可包括具有DNA和/或RNA作为核酸的病原体细胞或病原体，例如病毒或微生物，例如细菌或真菌。为简便起见，在下文中经常称为核酸，在此用其指称DNA和/或RNA。所述伴随细胞可包括人细胞，例如血液细胞等。可将待分析的液体称为样品，通常为液体的或液化的患者样品，例如血液、尿、粪便、痰、脑脊液、灌洗液、冲洗过的抹片或液化的组织样品。在提纯步骤中可提纯含于靶细胞-裂解液中的核酸并供入随后的分析中，通过其可验证某种病原体或基因，例如抗性基因的存在。所述随后的分析例如可通过测序、聚合酶链反应(PCR，聚合酶链式反应)，实时PCR和/或在微阵列上的检测或杂交进行。
[0011]由样品提纯靶细胞-核酸可在分解或裂解靶细胞之后通过随后将靶细胞-核酸吸附在固相例如二氧化硅(Silika)过滤器或微粒或所谓的微珠上来进行。除了用于裂解的化学和酶促方法外，还存在机械方法，例如借助超声波或微球或微珠。提纯的目的是给随后的扩增和/或检测提供浓缩形式的靶细胞-核酸。在分离靶细胞-核酸与细胞碎片和蛋白质时也可以有利地使用本发明的实施方式。但是，尤其是人血样品会额外包含大量的带有人DNA的伴随细胞。分离靶细胞和伴随细胞的一种可能性可能在于，首先选择性分解或裂解含于样品中的伴随细胞，例如血细胞并与靶细胞分离。然后，可将靶细胞裂解并可提纯靶细胞-核酸。可能靶细胞仅以很低的浓度存在于样品中。为在提纯前浓缩靶细胞，也可以例如离心分离样品或者经由过滤器冲洗样品。甚至在包含许多伴随细胞的样品的情况中，本发明的实施方式也可以将靶细胞-核酸与样品中存在的伴随细胞-核酸背景分离。否则，伴随细胞-核酸将干扰随后的靶细胞-核酸的扩增和分析，并且可能会使检测靶细胞的存在变得困难至不可能。因此，可防止伴随细胞-核酸在随后的扩增和分析中导致形成不希望的副产物并降低灵敏度。
[0012]根据一种实施方式，积聚步骤可具有借助积聚过滤器将靶细胞与样品分离的子步骤。在该分离子步骤中，可借助积聚过滤器截留靶细胞。这样的实施方式提供了能实现有效而可靠地选择靶细胞的优点。
[0013]在此，该积聚步骤可具有在分离靶细胞的子步骤之后的净化积聚过滤器的子步骤。为此例如可通过引导水或水性缓冲液通过该积聚过滤器来洗涤积聚过滤器。这样的实施方式提供了这样的优点，即样品中的其它成分，例如蛋白质被冲洗掉，而靶细胞以较大纯度存在。
[0014]该积聚步骤也可具有将样品温度调节到用于分解伴随细胞的裂解温度的子步骤和通过化学或酶促裂解来裂解伴随细胞并酶促消化由伴随细胞释放的核酸的子步骤。在此，调节温度的子步骤和裂解并消化的子步骤可在分离子步骤之前进行。也可适当选择裂解温度，以使含于样品中的伴随细胞被破坏或预先破坏，由此完整保留含于样品中的靶细胞。这样的实施方式提供了能实现特别有效而可靠地选择靶细胞的优点。在此，由于不同的细胞壁状况可有针对性地使用热处理。由于裂解，可防止过滤时的堵塞。
[0015]在此，裂解和消化子步骤可在调温子步骤之前、之中或之后进行。由此，可在裂解子步骤中降低样品的粘度。在这种情况中，尤其可在裂解和消化子步骤中使用耐温的酶。这样的实施方式提供了这样的优点，即由此在热预处理期间已经可以可靠地避免样品胶凝。
[0016]此外，在分解步骤中可借助超声波耦合分解靶细胞。这样的实施方式提供了这样的优点，即由于超声波引起的压力波和空化导致靶细胞的细胞壁特别可靠而快速地被破坏。
[0017]在分解步骤中可在过滤器上分解靶细胞，且过滤器的复合材料(Verb