亚家族e猿腺病毒a1302、a1320、a1331和a1337及其用图
【专利说明】亚家族E猿腺病毒Al 302、A1320、A1331和Al 337及其用途
[0001] 电子形式提交材料的纳入参考
[0002] 本文中以电子形式提交的序列表通过引用纳入本文。该文件的文件名为"UPN_ Y6334PCT_ST25 · txt"，创建于2013年5月 17 日，且是3，085，687字节（2 · 94MB)。
[0003] 发明背景
[0004] 腺病毒是双链DNA病毒，基因组大小约为36千碱基(kb)，由于能够在多种靶组织中 实现高效基因转移以及较大的转基因容量，它被广泛用于基因转移应用。通常，腺病毒的El 基因缺失并被取代为由所选启动子、感兴趣基因 cDNA序列和聚A信号组成的转基因盒，产生 复制缺陷型重组病毒。
[0005] 腺病毒的形态特征是由三种主要蛋白和许多群体小蛋白￥1，111、^、111&和1￥ &2 组成的二十面体衣壳，这三种主要蛋白是六邻体（II)、五邻体基质（III)和突结纤毛 (knobbed fibre) (IV) [W.C.RussellJ.Gen Virol.，81:2573-3704(2000年11月）]。病毒基 因组为线性双链DNA，末端蛋白共价连接于含有末端反向重复（ITR)的5 '末端。病毒DNA与高 碱性蛋白VII和小肽pX (先前称为mu)的密切相连。另一种蛋白V与此DNA-蛋白质复合物包装 在一起，并通过蛋白VI提供与衣壳的结构连接。该病毒也含有病毒编码的蛋白酶，这种蛋白 酶是加工某些结构蛋白以产生成熟的感染性病毒所必需的。
[0006]已发展出针对哺乳动物腺病毒家族的分类方案，所述哺乳动物腺病毒家族包括 人、猿、牛、马、猪、绵羊、犬和负鼠腺病毒。该分类方案是基于家族中腺病毒序列凝集血红细 胞能力的差异来发展的。结果是6个亚组，目前称为亚组A、B、C、D、E和F。参见T. Shenk等， Adenoviridae:The Viruses and their Replication〃（腺病毒科：病毒及其复制），第67 章，FIELD'S VIROLOGY(《费氏病毒学》），第6版，B.N Fields等编（林普科特瑞文出版社 (Lippincott Raven Publishers)，费城，1996)，第111-2112页。
[0007] 已报道可使用重组腺病毒将异源分子递送至宿主细胞。参见美国专利6,083,716， 其描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组。猿腺病毒C5、C6和C7描述于美国专利号7,247,472 中，可用作疫苗载体。其他黑猩猩腺病毒描述于WO 2005/1071093,可用于制备腺病毒疫苗 运载体。
[0008] 本领域中需要的载体应能将分子有效递送至靶标并最小化预存免疫对群体中所 选腺病毒血清型的影响。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了 6种全新的亚家族E猿腺病毒的分离的核酸序列和氨基酸序列，和包 含这些序列的载体。还提供了使用本发明的载体和细胞的多种方法。这些腺病毒包括^狀-Al302、SAdV-Al320、SAdV-Al331和SAdV-Al337。
[0010] 本文所述方法涉及通过给予本发明的载体递送一种或多种所选异源基因至哺乳 动物患者。还提供了用于递送分子至靶细胞的本文所述腺病毒或重组腺病毒。还提供了本 文所述腺病毒重组腺病毒在制备用于递送分子至靶细胞的药物过程中的用途。将本文所述 组合物用于疫苗使得所选抗原得以递呈，用于诱发保护性免疫应答。基于这些猿腺病毒的 载体还可用于在体外生产异源基因产物。这类基因产物本身可用于多种目的，如本文所述 的那些。
[0011] 下文中更详细描述了本发明的这些和其他实施方式和优势。
[0012] 附图简要说明
[0013] 图1是柱状图，反映了注射所示腺病毒载体后第8天和第14天T细胞对HIVgag(短） 的应答，所述腺病毒载体携带相同转基因。使用免疫显性HIVgag短CD8 T细胞表位 AMQMLKETKSEQ ID N0:410)，通过IFN-yELISPOT分析T细胞应答。
[00M]发明详述
[0015] 提供了 来自猿腺病毒 SAd V-A130 2、SAd V-A13 20、SAd V-A13 31 和 SAdV-A 13 3 7 的全新 核酸和氨基酸序列，所有这些序列都分离自黑猩猩粪便。
[0016] 还提供了全新的腺病毒载体和包装细胞系以生产基于这些序列的载体用于重组 蛋白或片段或其他试剂的体外生产。还提供了用于为治疗或疫苗目的递送异源分子的组合 物。这类治疗或疫苗组合物含有携带插入的异源分子的腺病毒载体。此外，全新的SAdV序列 可用于提供生产重组腺相关病毒(AAV)载体所需的必需辅助功能。因此，提供了这类生产方 法中使用这些序列的辅助构建体、方法和细胞系。
[0017] 当术语"基本同源"或"基本类似"指核酸或其片段时，其表示，在附带适当核苷酸 插入或缺失与另一核酸(或其互补链)进行最佳比对时，比对的序列存在至少约95至99%， 包括约96%、约97%、约98%和约99%的核苷酸序列相同性。
[0018] 当术语"基本同源"或"基本类似"指氨基酸或其片段时，其表示，在附带适当氨基 酸插入或缺失与另一氨基酸（或其互补链)进行最佳比对时，比对的序列存在至少约95至 99%，包括约96%、约97%、约98%和约99%的氨基酸序列相同性。优选在全长序列，或其蛋 白，或其至少8个氨基酸、或更理想至少15个氨基酸长度的片段上具有上述同源性。本文描 述了合适片段的示例。
[0019] 用于指代核酸序列时，术语"序列相同性百分数"或"相同性"指以最大对应性进行 比对时两条序列中相同的残基。在需要使用缺口以将一条序列与另一条进行比对时，相对 于无缺口罚分的较长序列计算评分程度。保持其编码的多核苷酸或多肽功能的序列较接近 相同。序列相同性比较的长度可涵盖基因组的全长(如约36kbp)，基因、蛋白、亚基或酶的开 放阅读框的全长[参见例如提供腺病毒编码区的表格]或者至少约500至5000个核苷酸的片 段。然而，也可能要求较小片段之间的相同性，例如至少约9个核苷酸、通常至少约20到24个 核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36或更多个核苷酸的片段。类似地，对于蛋白质全 长或其片段的氨基酸序列，可容易地确定"序列相同性百分比"。适当地，片段长度至少为约 8个氨基酸，也可长达约700个氨基酸。本文描述了合适片段的示例。
[0020] 以默认设置使用本文所定义的算法和计算机程序即可容易地确定相同性。优选 地，这类相同性涉及蛋白、酶、亚基的全长，或涉及长度至少约8个氨基酸的片段。然而，相同 性也可基于更短区域，其适用于应用相同基因产物时。
[0021] 如本文所述，用各种从公共渠道获得或购得的多序列比对程序（Multiple Sequence Alignment Programs)进行比对，例如可通过互联网Web服务器获得的"Clustal W"进行比对[Thompson等，1994 ,Nucleic Acids Res ,22,4673-4680]。或者，也可使用 Vector NTI?实用程序[英杰公司（InVitrogen)]。还有许多本领域已知的算法也可用于测 量核苷酸序列相同性，包括上述程序中所包含的那些算法。作为另一示例，可使用GCG 6.1 版中的程序Fasta来比较多核苷酸序列。Fasta可提供查询序列与检索序列之间最佳重叠区 域的比对和序列相同性百分比。例如，可使用GCG 6.1版(通过引用纳入本文)提供的Fasta 及默认参数(字长为6和用于计分矩阵的NOPAM系数)来确定核酸序列之间的序列相同性百 分比。可采用相似程序进行氨基酸比对。虽然本领域技术人员可视需要改变设置，但通常这 些程序都以默认设置使用。或者，本领域技术人员也可采用其他算法或计算机程序，其能够 得出与参考算法和程序至少同水平的相同性或比对。
[0022] 应用于多核苷酸时，"重组"指多核苷酸是克隆、限制性酶切或连接步骤和导致构 建体不同于天然存在的多核苷酸的其他步骤的多种组合的产物。重组病毒是包含重组多核 苷酸的病毒颗粒。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制体和原始病毒构建体的后 代。
[0023] 通常，"异源"表示来源于基因型与用作比较的剩余实体不同的实体。异源核酸序 列指不是分离自、来源于或基于天然产生的腺病毒载体核酸序列的任何核酸序列。"天然产 生"指在自然界中发现且不是以合成方式制备或修饰的序列。当序列分离自某一来源但经 修饰（如通过缺失、取代（突变）、插入或其他修饰)而不破坏源基因的正常功能时，该序列 "来源"于该来源。当序列与来源基本类似时，该序列"基于"该来源。
[0024] 例如，通过遗传工程技术导入不同物种来源(且通常是不同的属、亚科或科）的质 粒或载体的多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列上取下并可操作地连接至非天然 连接的编码序列的启动子是异源启动子。已克隆至病毒的基因组或病毒载体中的特定重组 位点（天然状态下病毒的基因组不包含该位点）是异源重组位点。异源核酸序列也包括天然 存在于腺病毒基因组中、但位于腺病毒载体中非天然位点的序列。当具有重组酶编码序列 的多核苷酸用于遗传改变通常不表达该重组酶的细胞时，对细胞而言，该多核苷酸和重组 酶都是异源的。
[0025] 异源疫苗指以下情形，即导入一种病毒或病毒载体以诱导针对另一物种的病原性 病毒的免疫。在这种情况下，术语"异源"指来源于具有不同种、属、亚科或科特异性的病毒 的接种抗原和刺激抗原(challenge antigen)。
[0026] 如本说明书和权利要求书中所用，术语"包括"及其变体，包括"包含"、"含有"等， 指包含其它的组分、元素、整数、步骤等。术语"由……组成"或"组成为"则不包含其他的组 分、元素、整数、步骤等。
[0027] I.猿腺病毒序列
[0028] 本发明提供了猿腺病毒 SAdV-Al 302、SAdV-Al 320、SAdV-Al 331 和 SAdV-Al 337 的核 酸序列和氨基酸序列，各分离自其在自然界中相关的其他材料。
[0029] A ·核酸序列
[0030] 本文中提供的SAdV-A1302核酸序列包括SEQ ID N0:1的核苷酸1至36430。本文中 提供的SAdV-A1320核酸序列包括SEQ ID NO: 25的核苷酸1至36603。本文中提供的SAdV-A1331核酸序列包括SEQ ID勵:50的核苷酸1至36647。本文中提供的34狀41337核酸序列 包括SEQ ID NO:77的核苷酸1至36639。参见序列表，其通过引用纳入本文。
[0031 ]在一个实施方式中，本发明的核酸序列还包括分别与SEQ ID NO: 1、25、50或77的 序列互补的链，以及对应于这些序列及其互补链的RNA和cDNA序列。在另一个实施方式中， 核酸序列还包括与序列表超过98.5 %相同和优选地超过约99 %相同的序列。在一个实施方 式中，还包括SEQ ID NO: 1、25、50或77中提供的序列及其互补链的天然变体和经工程改造 的修饰。这类修饰包括例如本领域已知的标记、甲基化以及使用简并核苷酸取代一种或多 种天然产生的核苷酸。
[0037] 在一个实施方式中，提供了SEQ ID NO: 1、25、50或77的序列及其互补链、与其互补 的cDNA和RNA的片段，以及与其基本同源的片段。合适的片段长度至少为15个核苷酸，并包 括功能片段，即生物学上感兴趣的片段。例如，功能片段可表达所需的腺病毒产物或可用于 生产重组病毒载体。这类片段包括本文表格中列举的基因序列和片段。表格提供了3六狀-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331和SAdV-A1337序列中的转录本区域和开放阅读框。对于某 些基因，转录本和开放阅读框(ORF)位于与SEQ ID NO: 1、25、50或77中所示序列互补的链 上。参见例如E2a、E2b和E4。还显示了经计算的所编码蛋白的分子量。注意Ela开放阅读框、 E2b开放阅读框和E4开放阅读框含有内部剪接位点。这些剪接位点见上表。
[0038] SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331 或 SAdV-A1337 腺病毒核酸序列可用作治疗 剂和多种载体系统和宿主细胞的构建中。如本文中所用，载体包括任何合适的核酸分子，包 括裸DNA、质粒、病毒、粘粒或原生质体。这些序列和产物可单独使用或与其他腺病毒序列或 片段联用，或与来自其他腺病毒或非腺病毒序列的元件联用。SAdV-A1302、SAdV-A1320、 SAdV-A1331或SAdV-A1337序列还可用作反义递送载体、基因治疗载体或疫苗载体。因此，还 提供了含有SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列的核酸分子、基因递送 载体和宿主细胞。
[0039]例如，本发明包括含有本发明的猿Ad ITR序列的非天然产生的核酸分子。"非天然 产生"指无法在自然界中找到且已通过重组、遗传工程或其他技术进行合成、重排或修饰的 序列或遗传元件，以及来自含相同物质的载体和宿主细胞的后代。在另一个实施例中，本发 明提供了含编码所需Ad基因产物的本发明猿Ad序列的核酸分子。鉴于本文中提供的信息， 使用本发明的序列构建的其他核酸分子对本领域技术人员而言是显而易见的。
[0040]在一个实施方式中，本文中鉴定的猿Ad基因区域可用于多种载体中，用于将异源 分子递送至细胞。例如，为表达腺病毒衣壳蛋白（或其片段)制备了载体，用于在包装宿主细 胞中生成病毒载体的目的。可设计这类载体用于以反式方式表达。或者，设计这类载体以提 供稳定含有表达所需腺病毒功能的序列的细胞，例如一种或多种Ela、Elb、末端重复序列、 E2a、E2b、E4、E40RF6 区域。
[0041]此外，腺病毒基因序列及其片段可用于提供辅助依赖性病毒(例如，缺失必要功能 的腺病毒载体，或腺相关病毒(AAV))的生产所必需的辅助功能。对于这类生产方法，可在这 类方法中以类似于人Ad所述的方式使用SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列。然而，由于SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列与人Ad序列 之间的差异，SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列的使用极大减少或消 除了在携带人Ad El功能的宿主细胞(如293细胞）中使用辅助功能进行同源重组的可能性， 其可能在rAAV生产过程中产生感染性腺病毒污染物。
[0042]使用腺病毒辅助功能生产rAAV的方法已详细描述于人腺病毒血清型的文献中。参 见例如美国专利6,258,595及其引用的参考文献。也可参见美国专利5,871，982; WO 99/ 14354;W0 99/15685;W0 99/47691。这些方法还可用于生产非人血清型AAV，包括非人灵长 类△△￥血清型。提供必需辅助功能的54狀-41302、54狀41320、54(^-41331或54(^-41337序 列（如Ela、Elb、E2a、E2b、DNA聚合酶和/或E40RF6)具体可用于提供必需的腺病毒功能，同时 最小化或消除与通常人来源的rAAV包装细胞中存在的任何其他腺病毒重组的可能性。因 此，所选基因或SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列的开放阅读框可用 于这些rAAV生产方法。
[0043] 或者，重组 SAdV-Al 302、SAdV-Al 320、SAdV-Al 331 或 SAdV-Al 337 载体可用于这些方 法。这类重组腺病毒猿载体可包括例如杂交黑猩猩Ad/AAV，其中黑猩猩Ad序列位于rAAV表 达盒的侧面，所述rAAV表达盒由例如AAV 3'和/或5' ITR和在控制其表达的调控序列控制下 的转基因组成。本领域技术人员应理解，其他猿腺病毒载体和/或SAdV-Al 302、SAdV-Al 320、 SAdV-A1331或SAdV-A1337基因序列也可用于生产rAAV和其他依赖腺病毒辅助的病毒。
[0044] 在又一个实施方式中，核酸分子被设计用于在宿主细胞中递送和表达所选腺病毒 基因产物以实现所需的生理作用。例如，可将包含编码SAdV-AnOSJAdV-AUSiKSAdV-AlSSl 或 SAdV-A1337Ela 蛋白的序列的核酸分子递送至对象以用作癌症治疗剂。可选地 ，这 类分子配制在基于脂质的运载体中并优先靶向癌细胞。这类制剂可与其他癌症治疗剂(如 顺铂、紫杉醇等)混合。本文提供的腺病毒序列的其他用途对本领域技术人员而言是显而易 见的。
[0045] 此外，本领域技术人员会容易地理解，可容易地使SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列适用于多种病毒和非病毒载体系统，用于体外、离体或体内递送治 疗性和免疫原性分子。例如，SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331 或 SAdV-A1337 猿 Ad 序列 可用于多种rAd和非rAd载体系统。这些载体系统包括例如质粒、慢病毒、逆转录病毒、痘病 毒、牛痘病毒和腺相关病毒系统等。这些载体系统的选择不是对本发明的限制。
[0046] 本发明还提供了用于生产本发明的猿和猿来源蛋白的分子。这类携带多核苷酸 (包括本发明的猿Ad DNA序列）的分子可以是裸DNA、质粒、病毒或任何其他遗传元件的形 式。
[0047] B · SAdV-Al 302、SAdV-Al 320、SAdV-Al 331 或 SAdV-Al 337腺病毒蛋白
[0048] 提供了本文所述腺病毒核酸所编码的SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或 SAdV-A1337腺病毒的基因产物，如蛋白质、酶及其片段。还包括具有由其他方法制备的这些 核酸序列编码氨基酸序列的SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337蛋白质、酶 及其片段。这类蛋白包括上表中所示开放阅读框编码的那些，下表中所示蛋白（参考SEQ ID N0,提供于序列表中），以及与其基本同源的序列。还提供了本文中所示蛋白和多肽的片段， 以及与其基本同源的片段。
[0051 ] *NC =序列表中不可编码的区域
[0052]因此，在一个方面，提供了独特的基本纯（即不含其他病毒和蛋白性蛋白）的猿腺 病毒蛋白。优选地，这些蛋白至少10%同源，更优选60%同源，且最优选95%同源。
[0053]在一个实施方式中，提供了独特的猿来源衣壳蛋白。如本文中所用，猿来源衣壳蛋 白包括含有上文所定义的SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337衣壳蛋白或 其片段的任何腺病毒衣壳蛋白，包括但不限于嵌合衣壳蛋白、融合蛋白、人工衣壳蛋白、合 成衣壳蛋白和重组衣壳蛋白，对制备这些蛋白的方法不作限制。本文所述衣壳可以是完整 的 SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331 或 SAdV-A1337 之一，可以含有 SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337中超过一种的衣壳蛋白，或者可以含有另一种腺病毒的衣 壳蛋白。
[0054] 合适地，这些猿来源衣壳蛋白含有一种或多种SAdV-Al 302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337区域或其片段(例如六邻体、五邻体、纤毛或其片段）以及不同腺病毒血 清型的衣壳区域或其片段，或修饰的猿衣壳蛋白或片段，如本文所述。本文中使用的"趋向 性改变相关的衣壳蛋白修饰"包括改变的衣壳蛋白，即五邻体、六邻体或纤毛蛋白区域或其 片段，如纤毛区域的突结结构域(knob domain)，或编码相同物质的多核苷酸，从而改变特 异性。可使用一种或多种本发明的猿Ad或者可以是人或非人来源的另一 Ad血清型构建猿来 源衣壳。这类Ad可获自多种来源，包括ATCC、商业和学术来源，或者Ad的序列可获自GenBank 或其他合适来源。
[0055] 提供了SAdV-A1302[SEQ ID N0:5]、SAdV-A1320[SEQ ID N0:29]、SAdV-A1331[SEQ ID N0:54]或SAdV-A1337[SEQ ID N0:81]的五邻体蛋白的氨基酸序列。合适地，该五邻体蛋 白或其独特片段可用于多种目的。合适的片段的示例包括基于上文和SEQ ID N0:5、29、54 或81中提供的氨基酸编码，在N端和/或C端截去约50、100、150或200个氨基酸的五邻体。其 他合适的片段包括较短的内部、C端或N端片段。此外，可对该五邻体蛋白进行修饰以用于本 领域技术人员已知的多种目的。
[0056] 还提供了SAdV-A1302[SEQ ID N0:9]、SAdV-A1320[SEQ ID N0:34]、SAdV-A1