一种制备人凝血因子viii的离子交换层析用洗涤缓冲液及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于血液制品领域，具体涉及一种制备人凝血因子VIII的离子交换层析用 洗涤缓冲液及其用途。
【背景技术】
[0002] 人凝血因子VIII(Human coagulation factorVDI，FVni)是一种重要的内源性凝血 因子，FVIII缺乏会导致严重的遗传性出血性疾病-甲型血友病。甲型血友病是最常见、发病率 最高的凝血因子缺陷病，最有效的治疗方法就是给患者输注富含FVIII的血浆制品，达到预防 和治疗的目的。因此，FVIII是甲型血友病患者的救命药。
[0003] FVI是以健康人血浆为原料，经分离、提纯，并经病毒去除和灭活处理、冻干制成。 《中国药典》2015版规定，人凝血因子VIII的比活性为每lmg蛋白质应不低于10.0IU，可见异 物除允许有微量细小蛋白颗粒外，其余应符合规定。
[0004] 制备FVI常用的方法有沉淀法和层析法，沉淀法包括等电点沉淀，盐析沉淀，醚沉 淀，酸沉淀和PEG沉淀等，层析法包括离子交换层析，亲和层析等。其中，离子交换层析法用 于制备FVIII具有纯度较高，重现性好，成本相对较低的优点，为国内外大多数厂家所采用。
[0005] FVIII分子量大、结构复杂，易失活，而且由于使用时需直接注射人体，对产品的可见 异物要求严格，因此对FVIII制备工艺的要求较高。采用现有工艺制备FVI时，对活性损失较 大，尤其是经80°C下，72小时干热处理后，活性损失严重；同时很难保证产品中的可见异物 合格。
[0006] 目前的制备工艺通常是在FVI最终配制时加入含白蛋白或糖醇或成分复杂的保护 剂，以保证产品的较高活性收率和可见异物合格，但是效果不够理想，而且造成成本升高。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种制备人凝血因子VIII的离子交换层析用洗涤缓冲液及制备FVIII 的方法。
[0008] 本发明提供了一种制备人凝血因子VIII的离子交换层析用洗涤缓冲液，它含有终 浓度为〇. 121-0.129M的氯化钠。
[0009] M:即mol/L〇
[0010] 进一步地，它含有终浓度为0.125M的氯化钠。
[0011] 其中，所述洗涤缓冲液包括如下配比的组分：
[0012] 氯化钠 0.121-0.129M，枸橼酸钠 0.005-0.015M，氯化钙0.0005-0.0015M，甘氨酸 0 · 116-0.126M，盐酸赖氨酸 0· 011-0.021M。
[0013] 进一步地，所述洗涤缓冲液包括如下配比的组分：
[0014] 氯化钠0.125M，枸橼酸钠0.01M，氯化钙0.001M，甘氨酸0.121M，盐酸赖氨酸 0.016M〇
[0015]其中，所述洗涤缓冲液的pH值为6.5-7.5。
[0016]进一步地，所述洗涤缓冲液的pH值为6.95-7.05。
[0017]更进一步地，所述洗涤缓冲液的pH值为7.0。
[0018] 本发明还提供了上述洗涤缓冲液在制备人凝血因子VIII中的用途。
[0019] 本发明提供了一种制备人凝血因子VIII的联合用离子交换层析缓冲液，它包括平 衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；
[0020] 所述洗涤缓冲液为上述洗涤缓冲液；
[0021] 所述平衡缓冲液包括如下配比的组分：氯化钠0.06-0.16M，枸橼酸钠0.005_ 0.015M，氯化钙0.0005-0.0015M，甘氨酸0.116-0.126M，盐酸赖氨酸0.011-0.021M;
[0022] 所述洗脱缓冲液包括如下配比的组分：氯化钠0.25-0.35M，枸橼酸钠0.005-0 · 015M，氯化钙0 · 0005-0 · 0015M，甘氨酸0 · 116-0 · 126M，盐酸赖氨酸0 · 011-0 · 021M。
[0023] 进一步地，所述平衡缓冲液包括如下配比的组分:氯化钠0.11M，枸橼酸钠0.01M， 氯化钙0.001M，甘氨酸0.121M，盐酸赖氨酸0.016M;
[0024]所述洗脱缓冲液包括如下配比的组分：氯化钠0.3M，枸橼酸钠0.01M，氯化钙 0.001M，甘氨酸0.121M，盐酸赖氨酸0.016M。
[0025]其中，所述平衡缓冲液、洗脱缓冲液的pH值为6.5-7.5。
[0026]进一步地，所述平衡缓冲液、洗脱缓冲液的pH值为6.95-7.05。
[0027] 更进一步地，所述平衡缓冲液、洗脱缓冲液的pH值为7.0。
[0028] 本发明还提供了一种制备人凝血因子VIII的方法，它包括如下步骤：
[0029] (1)取血浆，制备冷沉淀，溶解冷沉淀，样品预纯化，有机溶剂/去污剂结合法灭活 病毒，得待上柱样品；
[0030] (2)离子交换层析：以Toyopearl DEAE 650M凝胶为层析柱填料；
[0031]将步骤（1)得到的待上柱样品上层析柱，分别使用平衡缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱 缓冲液通过层析柱，收集得到含人凝血因子珊的洗脱液；
[0032]其中，平衡缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液如上述所示；
[0033] (3)对步骤(2)得到的洗脱液超滤，冻干、干热处理，既可。
[0034] 其中，
[0035] 步骤(1)中，所述样品预纯化采用聚乙二醇沉淀和氢氧化铝吸附结合的方式;所述 有机溶剂/去污剂为聚山梨酯80/磷酸三丁酯，所述灭活病毒的条件为:25 ± 1°C下，6小时； [0036]步骤(2)中，所有缓冲液的层析流速均为lOOcm/h;
[0037] 步骤(3)中，干热处理的条件为:80°C下，72小时。
[0038] 本发明还提供了上述方法制备得到的人凝血因子VIII。
[0039] 目前常用的离子交换层析用洗涤缓冲液的离子浓度为氯化钠0.15M。本发明人在 研究中意外地发现，洗涤缓冲液的离子强度对FVIII的活性收率与可见异物影响很大，在洗涤 缓冲液中氯化钠的终浓度为〇. 121 -0.129M时，即可以很好的维持FVI的较高活性收率与无 絮状物，可见异物合格，而离子强度太低，FVI的杂蛋白增多，容易出现絮状物;离子强度过 高，FVIII稳定性差，FVIII中间品和成品的活性收率急需下降，蛋白被激活，也容易出现絮状物。
[0040] 本发明提供的用于制备人凝血因子VIII的离子交换层析用洗涤缓冲液，通过控制 氯化钠的终浓度为0.121-0.129M，能较好的维持FVI制品的质量，包括活性、纯度和可见异 物。使用本发明的洗涤缓冲液和纯化方法，制备的FVIII中间样品的活性收率高、纯度高，无絮 状物出现;成品的复溶性能好，活性收率高、纯度高，稳定性好，可见异物合格;而且本发明 的洗涤缓冲液配方简单、成本低廉，具有良好的工业应用前景。
[0041] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0042] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0043]图1为FVI的制备流程图。
【具体实施方式】
[0044]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒 说明书选择。
[0045] 实验试剂:枸橡酸钠，氯化妈，氯化钠，甘氨酸，盐酸赖氨酸，Toyopearl DEAE 650M 凝胶均为市售品。
[0046] 实施例1本发明人凝血因子VIII的制备
[0047] 本发明人凝血因子VIII的制备流程见图1。
[0048]制备方法具体如下：
[0049] I、层析前处理
[0050] (1)以新鲜冰冻血浆为原料，经血浆融化，离心制备冷沉淀，0.02MTri s缓冲液溶解 冷沉淀，后经30 %聚乙二醇沉淀，氢氧化铝吸附后离心，得上清；
[0051 ] (2)上清经过0.45μπι澄清过滤后，加入Tween-80 (即聚山梨酯80)和磷酸三丁酯使 其最终浓度分别为1%和0.3%，251±1°〇处理6小时，完成第一次病毒灭活（8卩30病毒灭 活），得待上柱样品。
[0052] Π 、离子交换层析 [0053] (1)配制缓冲液
[0054] 平衡缓冲液包括如下配比的组分:0.01M枸橼酸钠，0.001M氯化钙，0.121M甘氨酸， 0 · 016M盐酸赖氨酸，氯化钠0 · 11M;调pH7 · 0;
[0055] 洗涤缓冲液包括如下配比的组分:0.01M枸橼酸钠，0.001M氯化钙，0.121M甘氨酸， 0 · 016M盐酸赖氨酸，氯化钠0 · 125M;调pH7 · 0;
[0056] 洗脱缓冲液包括如下配比的组分:0.01M枸橼酸钠，0.001M氯化钙，0.121M甘氨酸， 0 · 016M盐酸赖氨酸，氯化钠0 · 3M;调pH7 · 0;
[0057] (2)以Toyopearl DEAE 650M为凝胶为层析柱填料;将步骤I得到的待上柱样品上 层析柱，首先使用7-13倍层析柱体积的平衡缓冲液，层析流速为lOOcm/h;然后使用2-4倍层 析柱体积的洗涤缓冲液，层析流速为l〇〇cm/h;最后使用1-3倍层析柱体积的洗脱缓冲液，层 析流速为l〇〇cm/h;收集得到含人凝血因子珊的洗脱液。
[0058] III、FVIII成品的制备
[0059] (1)超滤：用含枸橼酸钠、氯化钙、盐酸精氨酸的缓冲液对步骤Π 获得的洗脱液进 行超滤透析，超滤透析完成后，加入人血白蛋白使其浓度为8g/L;
[0060] (2)再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作80°C，72小时的干热处理，即得。
[00611 得到的FVIII制品的活性收率为67.5%，比活性为40.5IU/mg;复溶后外观澄清，无 絮状，可见异物合格，符合药典规定。
[0062 ]实施例2本发明人凝血因子VIII的制备 [0063]制备方法具体如下：
[0064] I、层析前处理
[0065] 同实施例1。
[0066] Π 、离子交换层析
[0067] (1)配制缓冲液
[0068] 平衡缓冲液包括如下配比的组分:0.01M枸橼酸钠，0.001M氯化钙，0.121M甘氨酸， 0.016M盐酸赖氨酸，氯化钠0.06M;调pH6.5;
[0069] 洗涤缓冲液包括如下配比的组分:0.01M枸橼酸钠，0.001M氯化钙，0.121M甘氨酸， 0.016M盐酸赖氨酸，氯化钠0.121M;调pH6.5;
[0070] 洗脱缓冲液包括如下配比的组分:0.01M枸橼酸钠，0.001M氯化钙，0.121M甘氨酸， 0.016M盐酸赖氨酸，氯化钠0.25M;调pH6.5;
[0071] (2)以Toyopearl DEAE 650M为凝胶为层析柱填料;将步骤I得到的待上柱样品上 层析柱，首先使用7-13倍层析柱体积的平衡缓冲液，层析流速为lOOcm/h;然后使用2-4倍层 析柱体积的洗涤缓冲液，层析流速为l〇〇cm/h;最后使用1-3倍层析柱体积的洗脱缓冲液，层 析流速为l〇〇cm/h;收集得到含人凝血因子珊的洗脱液。
[0072] III、FVIII成品的制备 [0073] 同实施例1。