靶向vegf双特异性抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗人靶向血管内皮生长 因子(VEGF)双特异性抗体和其在制备抗肿瘤药物以及在制备诊断或治疗眼科疾病的试剂 或药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，近年来其发病率呈明显上升趋 势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，往往预后不佳。目前临床上所采用的三大常规治 疗方法:化疗、放疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方 法均存在一定局限性，其疗效难以进一步提尚。
[0003] 血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，肿瘤的生长有两个明显不同的阶 段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，从而促进肿瘤增殖、侵袭。 新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血 管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) JEGF能与细胞表面的血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor ;VEGFR)结合，该类受体包括3种高亲和力的酪氨酸激酶受体，即FLTi/ VEGFRi ALKi/KDR/VEGFR〗和FLT4/VEGFR3，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能，可以 促进内皮细胞增殖、迀移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围 组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成和肿 瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。
[0004] 靶向VEGF抗体在抗肿瘤治疗中有如下优势：靶点直接暴露于血液中，便于药物直 接作用;可抑制肿瘤的转移;靶点基因表达稳定，不易产生抗药性;有下游放大效应;无需考 虑肿瘤的组织学特性;不良反应相对较少。大量结果证，VEGF在促进肿瘤血管生成过程中起 重要作用，阻断VEGF被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。如Genentech公司的贝 伐单抗(Avastin，bevacizumab)是抗人VEGF的人源化抗体(Cancer Res 1997;57:4593-9)， 已于2004年2月获得美国FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌。它通过抑制VEGF的 活性，包括内皮细胞增强血管通透性活性、促有丝分裂活性和其他促血管生成活性，从而抑 制新生血管的形成，减少肿瘤的血供、氧供和其他营养物质的供应而抑制肿瘤生长。
[0005] 视网膜血管系统和脉络膜血管系统是组成视网膜的重要组成部分。创伤或疾病而 引起的血管壁结构或功能的异常改变是导致视力下降或视力丧失的主要原因。例如，糖尿 病视网膜病变是由于糖尿病而导致的视网膜血管增生，进而造成视网膜脱落，为患者视力 丧失的主要原因。在眼睛受伤或手术后的恢复过程中也可能造成视网膜内新生血管的生 长。这一类视网膜血管增生也是造成视力下降或眼睛失明的重要原因 （Nature 438:932-938,2005)。年龄相关的黄斑变性(AMD)是一种由视网膜中心区的细胞或组织退化和血管增 生而引起的疾病。可分为干性和湿性两种。其中湿性AMD是脉络膜新生血管形成的最常见形 式，是引起患者眼睛失明的主要原因。
[0006]很多研究表明一旦眼睛视网膜的感光细胞由于营养不足而开始萎缩(称作"缺血 性萎缩"），VEGF在视网膜内的浓度便开始升高，从而促使新生血管生长。这一过程称为"新 生血管的形成"。在眼内，新生的血管形态上与正常血管不同，官腔不规则，管壁多为渗漏。 这种高通透性或渗漏的血管的异常增生常导致视网膜上产生疤痕，并进一步可发生脱落从 而影响到视力。
[0007] 研究表明湿性A M D病人的脉络膜组织中有高水平的V E G F表达 (Invest.Opthal.Vis·Sci 37:855-868，1996;Microvascular Res·64:162-169，2002)〇 由 于VEGF表达水平与湿性AMD之间的相关性，VEGF可以被用作诊断AMD的生化指标 (Br. J. Opthalmol. 88:809-815，2004)。糖尿病性黄斑水肿是一种糖尿病相关眼并发症，会 导致患者视力模糊、严重视力丧失甚至失明。糖尿病是导致美国成人失明的主要原因，在美 国糖尿病性黄斑水肿影响到约56万糖尿病患者，而有报报道称有视力问题的糖尿病患者数 高达近400万人。而VEGF提高血管渗透性的蛋白，引起糖尿病患者眼毛细血管泄漏和黄斑水 月中。雷尼株单抗(Lucentis，ranibizumab)是Genentech公司开发的一个革巴向VEGF的单克隆 抗体，它已于2006年6月被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗新生血管型年龄相关黄 斑变性。并于2012年8月，美国FDA批准了雷尼珠单抗一个新适应证，即以每月（约28d)l次玻 璃体内注射〇. 3mg(制剂规格为6mg/ml，取其0.05ml)方案治疗糖尿病患者的糖尿病性黄斑 水肿所致视力损害。糖尿病性黄斑水肿的现标准治疗方法为激光手术，但此虽可减缓患者 的视力丧失和帮助稳定视力，却几乎不能恢复已丧失了的视力。雷尼珠单抗属抗体片段类 VEGF抑制剂，无疑雷尼珠单抗为该类病人带来了希望。
[0008] 进入上世纪90年代以后，抗体库技术的出现使人源化抗体的制备达到了一个全新 的水平，它绕过了以往单抗研制过程中必需的杂交瘤途径，甚至不需要经过免疫，更为重要 的是，它使人们长期以来期望获得治疗性人源抗体的梦想成为了现实，因而显示出强大的 生命力。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示是由Smith (Science ,1985,228(4705) :1315-1317)首先建立起来的一种将外源蛋白基因与噬菌体的 衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用 了以上原理使不同特异性的抗体表达在不同的噬菌体表面而用抗原对它们进行筛选 (Science,1989,246(4935):1275-1281；Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(18):7978-7982;Human Antibodies,1997,8(4): 155-168)。用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以是杂 交瘤细胞、免疫的人B细胞或未经免疫的人B细胞。未经免疫的人B淋巴细胞是目前应用最多 的靶细胞，它库容量大，理论上含有所有的人源抗体基因。
[0009] 噬菌体抗体库的筛选就是模拟体内抗体亲和力成熟的过程，用固相化抗原吸附表 面表达特异性抗体的噬菌体库，然后洗脱游离的噬菌体，用抗原吸附的噬菌体感染宿主菌 增殖扩增后再进行多轮的"吸附一洗脱一扩增"直至筛选到特异的人源抗体。大容量抗体库 的建立是获得高亲和力人源抗体的关键，如果构建的噬菌体抗体库容量大于1〇 1()，那就可能 从中筛选得到高亲和力U 1〇9Μ<)的特异性抗体。
[0010]在临床试验中已有联合运用两种单克隆临床前实验的报道，但这种联合应用单克 隆抗体的却有很多限制性。例如，联合应用两种单克隆抗体的的安全性和效果需要分别去 评价，由此产生的长周期，高昂的开发费用限制其研制进程，而双特异性抗体恰好解决了这 一瓶颈。此外，部分双特异抗体还能获得其亲本单克隆抗体所不具备的一些新的特性:如往 往具有比原亲本抗体更低的解离速度，更强的封闭作用等。
【发明内容】
[0011]本发明的第一个目的在于提供一种靶向血管内皮生长因子双特异性抗体或抗体 片段;第二个目的在于提供编码这些抗体或抗体片段的基因序列以及能够对基因进行表达 的载体;第三个目的在于挖掘这些抗体或抗体片段的用途。
[0012]为了实现本发明的第一个目的，本发明提供了一种双特异性抗体BeV-B5E 3BsAb，其 具有包含高变区〇^1、〇)1?2丄01?3、0)1?4丄01?5、0)1?6的重链可变结构域以及包含高变区0)1? 1/、 CDR2'、CDR3'、CDR4'、CDRs'、CDR6'的轻链可变结构域。其中，CDR^氨基酸序列为:Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly; CDR2的氨基酸序列为：Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro; CDR3 的氨基酸序列为：Ala-Lys-Tyr-Pro-His-Tyr-Tyr-Gly-Ser-Ser-His-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val ;Q)R4的氨基酸序列为:Gly-Gly-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr_Ala;CDR5的氨基酸序列为： Ile-Ile-Pro-Ile-Phe-Gly-Thr-Ala; CDR6的氨基酸序列为：Ala-Arg-His-Trp-Gly-Tyr-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile; CDRi'的氨基酸序列为：Gln-Asp-Ile-Ser-Asn-Tyr; CDR2'的氨基酸 序列为：Phe-Thr-Ser; CDR3 ' 的氨基酸序列为：Gln-Gln-Tyr-Ser-Thr-Val-Pro-Trp-Thr; ⑶RZ的氨基酸序列为：Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Ser-Tyr 的氨基酸序列为:Gly-Ala- Ser ;CDR6' 的氨基酸序列为：Gln-Gln-Tyr-Gly-Ser-Ser-Pro-Tyr-Thr。
[0013] 该双特异性抗体BeV-B5E3BsAb选自抗VEGF的双特异性抗体以及所述双特异性抗体 片段中的任意一种，双特异性抗体片段为双特异性抗体的Fab片段或F(ab'） 2片段。
[0014] 双特异性抗体Bev-B5E3BsAb的抗体片段上述双特异性抗体Bev-B5E 3BsAb的Fab片 段或F(ab'）2片段。
[0015] 上述人源化抗体由噬菌体展示技术而得到。本发明所述的人源化抗VEGF抗体及其 功能性片段除具备上述抗VEGF抗体及其功能性片段的有利特性外，还以高亲和力结合人 VEGF蛋白。
[0016] 在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、 添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所 述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可 变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少 有95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软 件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。
[0017] 本发明的抗体可以是全长的（例如，IgGl或IgG4抗体）或可仅包含抗原结合部分 (例如，Fab、F(ab '）2或scFv片段），或可以被修饰以影响功能。在一些应用中，进行修饰以除 去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上