一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表 位肽复合物。
【背景技术】
[0002] 甲胎蛋白（AFP)作为一种肿瘤胚胎抗原，免疫原性很弱，AFP对肝癌生长的促进作 用以及对免疫细胞的抑制作用，提示其可以成为一种靶点在肝癌的生物治疗中发挥作用。 近来的研究证实甲胎蛋白存在不同的抗原表位为肝细胞癌的免疫治疗提供了解决问题的 途径。Butterfield等研究发现在小鼠的免疫系统中也找到了诱发T细胞反应的甲胎蛋白抗 原表位肽，不但可以在体诱发针对表达AFP肿瘤细胞的免疫反应，而且产生的保护性免疫效 应可以克服AFP的免疫抑制，为肝癌的防治提供新的策略。但是AFP在患者体内不能被有效 地递呈和激活免疫细胞是防治策略实施的瓶颈所在。通过增强AFP的免疫原性使免疫细胞 对其产生强而有效的主动识别对于肝癌的治疗有重要意义。目前增强AFP特异性免疫反应 的策略集中于AFP核酸疫苗，基因重组AFP载体介导DC细胞免疫和AFP质粒与腺病毒多基因 重组联合免疫，动物实验结果显示上述免疫策略可以检测到一定水平的特异性T细胞反应， 但是相对有限的体内保护效应，复杂的基因技术操作程序，可能产生的耐性疫苗及重组基 因的安全性问题局限了之后的深入研究。增强AFP免疫原性的另一个重要而简便的方法就 是应用有效的免疫佐剂，而热休克蛋白70的"分子伴侣"和"内在佐剂"作用成为解决的有效 策略。
[0003]已证实热休克蛋白70具有良好的"免疫佐剂"效应，其与不同的肿瘤抗原肽相伴可 诱发肿瘤特异性主动免疫。研究表明对某个抗原的保护性细胞反应可以通过HSP70偶联抗 原肽复合物免疫而实现，尤其对于抗原弱或难以诱发免疫的抗原，HSP70呈现了良好的内在 免疫佐剂效应。本研究在前期工作基础上通过简便实用的氨基酸偶联法构建HSP70功能肽-AFP表位肽复合物，合成多肽能较好的保持肽的结构，具有成本低，合成量多，反应快，产物 相对稳定等优点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种热休克蛋白70与甲胎蛋白抗原表位肽的复合物及其 制备方法。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物，由热休克蛋白70功能肽 和甲胎蛋白抗原表位肽偶联构成，所述的复合物的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本发明所述的热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽按照摩尔比为1:1。
[0008] 本发明所述的热休克蛋白70功能肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述的甲 胎蛋白抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009] 本发明所述的复合物在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。
[0010] 一种治疗肝癌的药物组合物，包括上述所述的热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗 原表位肽复合物及一种或多种药学上可接受的辅料。
[0011] 所述辅料包括:水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等。
[0012] 所述的水溶性填充剂辅料为选自以下的一种或一种:甘露醇、低分子右旋糖苷、山 梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。
[0013] 所述的PH调节剂为选自以下的一种或几种:枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非 挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵、碳酸钠或碳酸钾或碳酸铵盐、 碳酸氢钠或碳酸氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐等。
[0014] 所述的稳定剂为选自以下的一种或几种:EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚 硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十 二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇 6000、三羟甲基氨基甲烷。
[0015] 所述的渗透压调节剂是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。
[0016] 所述药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻 干粉或溶液注射剂。
[0017] 本发明的有益效果为:通过简便实用的氨基酸偶联法构建HSP70功能肽-AFP表位 肽复合物，合成多肽能较好的保持肽的结构，具有操作简单，成本低，合成量多，反应快，产 物相对稳定等优点。
【附图说明】
[0018] 图1是HSP70-P/AFP-P复合物的高效液相色谱图；
[0019] 图2是HSP70-P/AFP-P复合物质谱分析图；
[0020] 图3是实施例2体内H22肝癌荷瘤小鼠治疗实验数据；
[0021 ]图4是实施例3淋巴细胞毒性试验实验数据。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。 [0023]实施例1多肽的合成及鉴定
[0024] 根据热休克蛋白70(HSP70)功能肽TKDNNLLGRFELSG和甲胎蛋白（AFP)FMNKFIYEI合 成所需的氨基酸，采用固相多肽合成技术，以Ν-α-Fmoc保护的氨基酸为原料，Fmoc-AA-Wang 树脂为载体，HBTU方法偶联。
[0025] 具体步骤为：
[0026] 1 ·将树脂Fmoc-AA-Wang树脂（lmmol)用哌啶-DMF(V: V = 1: 5)脱除Fmoc保护基，15 分钟。
[0027] 2.DCM 和 DMF 洗涤后，分别加入 Fmoc 保护基-氨基酸（3mmol)、HBTU(3mmol)、DIEA (3mmol)进行偶联，30分钟。
[0028] 3. DCM和DMF洗涤后，循环以下步骤:脱除Fmoc保护基-洗涤-偶联-再洗涤，直至最 后一个氨基酸偶联结束，完成整条肽链的合成，按照IEYIFKNMFGSLEFRGLLNNDRT顺序依次偶 联。
[0029] 4.以切肽试剂TFA:苯甲硫醚:苯酚:乙二硫醇:双蒸水(82.5: 5:5:2.5:5)将多肽从 载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，2小时。
[0030] 5.加入4°C预冷的乙醚100ml使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤3遍，真 空抽干，得到多肽粗品。
[0031] 纯化：将得到的粗品多肽分析鉴定，粗品用制备型反相液相色谱（RP-HPLC)法纯 化，以HPLC和MS分析鉴定。色谱柱为Sy_etrix 0DS-R，4 · 6*250_，5μπι;流动相A: 0 · 1 %TFA/ 乙腈，流动相B: 0.1 %TFA/H20;线性洗脱梯度：18 %A-43 ;流速为lml/min，检测波长为 220nm; -次检测进样量为20μ1。经冷冻干燥机后得到精品多肽。
[0032] 其中AA=Amino Acid氨基酸
[0033]