一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖酸是一种多功能有机酸，广泛应用于食品、洗涤、药物和建筑等行业。葡萄 糖酸能够通过葡萄糖氧化酶在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成。由于微生物具 有生长繁殖速度快、来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生 产菌株为黑曲霉(NRRL 3)。工业上常采用黑曲霉营养细胞或者合成酶作为生物催化剂在生 物催化系统中的连续化操作获取葡萄糖酸。各种理化因素，化学品以及降解酶的释放，易引 起酶的失活。加之，葡萄糖转化成葡糖酸的生物催化反应是氧化反应，如果通气不好该过程 不能很好地进行，而利用菌丝营养体形式的黑曲霉使得发酵液变得非常粘稠，导致通风和 产品混合困难。
[0003] 孢子是生物体产生的一种具有繁殖或休眠作用的特殊生命形式，能在恶劣的环境 下保持自有的传播能力，并再在有利条件下直接发育成新个体。尽管孢子被认为是代谢惰 性的，但它们却是极好的酶贮藏库和非常有前景的生物催化剂。大量研究表明，霉菌孢子具 有很高的特异性催化活性，能介导高效的生物转化反应。Schleg and Knight等首先将赭曲 霉孢子应用于11a羟化类固醇的催化中，并推广应用于一定规模的工业生产中；Larroche等 将青霉孢子应用于催化辛酸转变成2-庚酮从而产生蓝乳酪味上;Wolken等利用鲁氏毛霉孢 子产生β-酮酯。Ramachandran等研究表明黑曲霉孢子具有葡萄糖氧化酶活性，即使孢子在-20°C下贮存3个月也不会丢失任何酶活性。因此，开发黑曲霉孢子作为转化葡萄糖产葡萄糖 酸的生物催化剂具有以下优势：消除反应的迟滞期、可重复使用孢子、减少副产物、易于进 行产物分离。此外，相对小的、椭圆形和圆形的孢子可避免转化液的粘稠化所带来的不易通 风通气的劣势。但是黑曲霉孢子的刚性膜结构充当了天然屏障，导致酶与催化底物无法接 触。因此，利用新鲜孢子作为催化剂生物转化葡萄糖产葡萄糖酸的反应不能顺利进行，葡萄 糖酸产量接近零。此外，生物转化反应进行过程中如果孢子萌发将大大降低葡萄糖酸的产 量。
[0004] 基于以上原因，本发明提出了一种可转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制 备和应用方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是要克服现有方法不足之处而提供一种在转化葡萄糖产葡萄糖酸 反应中不易失活、易于分离的生物催化剂黑曲霉孢子及其制备和应用方法。
[0006] 为了实现上述技术目的，本发明的技术方案如下。
[0007] -种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤一:将黑曲霉接种于斜面固体培养基活化；
[0009]步骤二:活化后的黑曲霉接种于液体培养基培养后收集黑曲霉孢子；
[0010]步骤三:将收集的黑曲霉孢子进行水洗、冻融和加入萜类试剂处理，获得能够进行 生物转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子。
[0011]所述步骤一:将黑曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面，25~35°C培养7~10 曰。
[0012] 所述步骤二：用含有0 · 05 %~0 · 5 % (V/V)Tween-80或Tween-20的灭菌去离子水冲 洗培养黑曲霉7-10日的斜面后，调取108~109sp〇res/mL的黑曲霉孢子悬液，将其接种于荞 麦种子培养基，接种量为10 8~109spores/100g荞麦种子，培养168~240h。
[0013]所述的荞麦种子培养基的制备方法如下：荞麦种子300g用去尚子水洗净，用等量 的去离子水煮熟，l〇〇°C沸水浴15~20min软化组织;倒掉多余的水分，分装于锥形瓶中，高 压蒸汽灭菌处理，通过该方法处理所获得的荞麦种子培养基为:l〇〇g荞麦种子含水50g。 [0014] 所述步骤二：将含有0 · 05 %~0 · 5 % (V/V)Tween-80或Tween-20的灭菌去离子水加 入培养后的黑曲霉的荞麦种子培养基中，100~500rmp振摇1~5h后，无菌条件下，用灭菌薄 纱布过滤，收集滤液，5，000~20，000g离心10~20min，弃掉上清液，收集下部黑曲霉孢子沉 淀。
[0015] 所述步骤三水洗过程是将含有〇 · 05 %~0 · 5% (V/V)Tween_80或Tween-20的灭菌 去离子水于收集的黑曲霉孢子中，在5,000~20,00(^，4°(3下离心10~301]1；[11，弃掉上清液， 收集下部沉淀，重复水洗步骤η次后，1 < η < 25，收集孢子待用。
[0016] 所述步骤三将水洗后获得的黑曲霉孢子沉淀置入-20°c冰箱、-80°c低温冰箱或液 氮罐中保持48h以上，然后从冰箱中取出，置于室温条件下，让其迅速溶解。
[0017] 所述步骤三加入Ι-lOwt%萜类化合物处理3-18h，收集孢子待用。
[0018] 所述的萜类化合物为单萜或类单萜化合物，包括:柠檬醛、柠檬烯、萜品醇、月桂 烯、芳樟醇、苔黑酚、松油醇、香芹醇中的一种或几种。
[0019] -种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子，是由上述的方法制备而成的。
[0020] 所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子的应用方法：
[0021] 将所述的黑曲霉孢子葡萄糖溶液加入带搅拌设备的反应容器中使得黑曲霉孢子 终浓度为1〇8~101()sp 〇res/mL，和葡萄糖溶液终浓度为20~60g/L，反应器的底部以0.05~ 0.5L/min连续通风，且装有Κ0Η溶液的柱子吸收C0 2，25~35°C下转化168~240h。
[0022] 本发明在生物转化反应结束后，采用二硝基水杨酸法和葡萄糖酸试剂盒分别测定 转化溶液中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。在生物转化反应结束后回收作为生物转化的黑曲霉 孢子进行重复转化使用，使用次数可达14次。
[0023]本发明对比已有方法来说，提出了使用黑曲霉孢子生物转化葡萄糖产葡萄糖酸的 新思路，是对传统方法的思维创新;提出了采用水洗、冻融和加入萜类试剂处理孢子，解决 胞内葡萄糖氧化酶不易与底物接触的不足，是对传统方法的技术创新;所制备的孢子在催 化转化反应中具有不易丢失酶活性，反应产物易于分离，同时还避免了转化液的粘稠化所 带来的不易通风通气的劣势。
[0024]本发明的技术效果在于：
[0025] 1、本发明提供了一种可用作转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应 用方法；
[0026] 2、黑曲霉孢子制备方法简单、易于保存、批次稳定、可实现重复使用；
[0027] 3、转化培养基成分简单，转化产物易于分离，生产成本低，工艺简单，易于工业化 应用。
【附图说明】
[0028]图1(a)新鲜黑曲霉孢子；（b)经冻融（48h)+3%citral(10h)处理的黑曲霉孢子； (c)经冻融(48h)+10%citral(10h)处理的黑曲霉孢子。
【具体实施方式】
[0029]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0030] 实施例1相关培养基的制备
[0031] 1 )PDA培养基将马铃薯洗净、去皮、切成小块，再称取200g，加水煮烂（煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤，加热，再根据实际实验需要加15g琼脂，继 续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至l〇〇〇mL， 分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121°C灭菌20min左右后取出试管摆斜面，获得PDA培养 基，冷却后贮存备用。
[0032] 2)荞麦种子培养基荞麦种子(300g)用去尚子水洗净，用等量的去尚子水煮熟，沸 水浴（100°C，15min)软化组织，倒掉多余的水分，分装于锥形瓶中，瓶口用棉塞和报纸包扎 好，高压蒸汽灭菌处理（121°C，15psi约0.1 MPa下15min)。通过该方法处理所获得的荞麦种 子培养基为：l〇〇g荞麦种子含水50g。
[0033]实施例2黑曲霉孢子(源自黑曲霉ATCC 9029,购自美国模式培养物集成库，但不限 于这一种菌株)的获取
[0034] 将黑曲霉接种于PDA培养基斜面，30°C培养7日；用含有0.1%Tween_80(或Tween-20)的灭菌去离子水冲洗黑曲霉roA培养斜面，获得黑曲霉孢子悬液，采用比浊法调节成浓 度为108spores/mL的孢子悬液，将其接种于荞麦种子培养基(接种量为108spores/100g荞麦 种子），培养200h。加入含有0 · 1 % Tween-80 (或Tween-20)的灭菌去离子水于培养了 20