一种香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及香菇分子生物学技术领域，具体涉及一种香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因及应用。
【背景技术】
[0002]香菇由于味美、香气浓郁、抗癌等特性，深受消费者喜爱，世界上有60多个国家和地区民众都有消费香菇的习惯。我国是香菇生产和出口大国，香菇产业的发展关系着我国食用菌产业的整体发展。然而，香菇中甲醛超标导致的食品安全和“绿色壁皇”问题困扰着我国香菇产业的发展。研究发现，香菇中甲醛是香菇在生长发育及采后干燥过程中逐步形成，是香菇的正常生理代谢产物，属于内源甲醛。香菇甲醛问题对香菇的生产、消费、出口创汇和食用安全造成极大不利影响。半胱氨酰亚砜裂解酶(S-alkyl-L-cysteine sulfoxidelyase, C-S 1 yase)是香菇内源甲醛产生途径中的一种关键酶。
[0003]半胱氨酰亚砜裂解酶(又称为蒜氨酸酶，EC4.4.1.4)主要分布于大蒜、洋葱、韭葱、葱等葱属植物中。目前，编码半胱氨酰亚砜裂解酶的基因已经从大蒜、洋葱、火葱、韭菜等植物中分离出来，不同物种来源的半胱氨酰亚砜裂解酶基因的同源性从51%到70%。另夕卜，同一种物种不同部位的半胱氨酰亚砜裂解酶的氨基酸序列也可能不同。唐巧玲等(唐巧玲等.一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用，见中国发明专利公开号CN104928273A文献)克隆了一种新的大蒜半胱氨酰亚砜裂解酶编码基因，并通过毕赤酵母表达系统获得重组蛋白。然而，未见关于香菇半胱氨酰亚砜裂解酶分子水平鉴定方面的研究报道，更没有克隆出编码香菇半胱氨酰亚砜裂解酶的基因，其原因主要分为2个方面:一是由于香菇半胱氨酰亚砜裂解酶的纯化难度较大，二是香菇基因组数据未公布。将葱属植物来源的半胱氨酰亚砜裂解酶的氨基酸序列在申请人构建的香菇基因组中搜索，没有找到其同源序列，这表明香菇半胱氨酰亚砜裂解酶可能是一种不同于葱属植物半胱氨酰亚砜裂解酶的未知新蛋白，编码该蛋白的基因是一个新基因。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于提供香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因，其序列为SEQIDN0.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID N0.2所示。
[0005]本发明的目的之二在于提供香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因的克隆方法，克隆该基因的引物包括CTAGCTAGCATGTCCAATACACAATCCATCGCGC和CCGCTCGAGTCAAGGCCTAATGGAAGCAAGCTGCo
[0006]本发明最后的目的在于提供了香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因在制备香菇半胱氨酰亚砜裂解酶重组蛋白中的应用。
[0007]为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案:
[0008]一种香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因，序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]—种克隆香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因的方法，包括:
[0010]模板:香菇子实体cDNA，引物如下:
[0011 ] Csl-Nhe I 5’ -CTAGCTAGC ATGTCCAATACACAATCCATCGCGC-3 ’
[0012]Csl-Xho I 5’-CCGCTCGAG TCAAGGCCTAATGGAAGCAAGCTGC-3’。
[0013]香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因在制备香菇半胱氨酰亚砜裂解酶重组蛋白中的应用，包括利用本发明提供的基因序列进行香菇半胱氨酰亚砜裂解酶重组蛋白的表达。
[0014]本发明的保护范围还包括包含有SEQID N0.1所示核苷酸序列的载体。
[0015]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0016]本发明首次克隆出香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因。构建了含有该基因的原核表达载体，并通过大肠杆菌外源表达获得了具有酶活力的重组香菇半胱氨酰亚砜裂解酶。
[0017]本发明克隆出的香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因与目前报道的其它半胱氨酰亚砜裂解酶基因具有明显差异性，是一种新的半胱氨酰亚砜裂解酶基因，为进一步研究该基因家族进化关系提供条件。
[0018]本发明为利用基因工程技术调控香菇内源甲醛产生提供了更多的基因资源，也为研究生物内源甲醛带来的食品安全问题提供更开阔的思路。
【附图说明】
[0019]图1为目的基因序列的琼脂糖凝胶电泳图。
[0020]泳道1:DNA marker;泳道2:目的基因(1494bp)。
[0021 ]图2为重组半胱氨酰亚砜裂解酶蛋白的SDS-PAGE图。
[0022]泳道1:蛋白marker;泳道2:目的蛋白(54kDa)。
[0023]图3为重组半胱氨酰亚砜裂解酶对香菇内源甲醛产生量的影响。
[0024]GGT: γ-谷氨酰转肽酶;C-S lyase:半胱氨酰亚砜裂解酶。
具体实施方案
[0025]本发明实施例所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规技术;所用试剂或材料，如未特备说明，均来源于商业渠道。
[0026]实施例1:
[0027]香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因(Csl)克隆
[0028]1)提取样品RNA。称取0.5g香菇子实体置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末，将粉末收集于1.5mL不含RNA酶的离心管中；加入300yL抽提缓冲液和600yL PCI溶液(将水饱和酚、氯仿、异戊醇按25:24:1的体积比混合所得到的溶液)，在振荡器上剧烈振荡30s，4°C，12000g离心15min;吸取上清液于另一个干净的1.5mL不含RNA酶的离心管中，加入等体积的PCI溶液，轻微振荡30s，4°C，12000g离心15min。离心完毕后，若中间层固体物质过多，重复该步骤一次;吸取上清液于另一个干净的1.5mL不含RNA酶的离心管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠溶液，混匀后加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，于_20°C下放置lh;4°C，12000g离心lOmin，弃上清，用预冷的70 %乙醇洗涤沉淀;4°C，12000g离心5min，弃掉乙醇，将沉淀在超净工作台上干燥；用适量的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的双蒸水溶解沉淀，于_70°C保存备用。
[0029]2)香菇cDNA第一链的合成。以去除DNA之后的总RNA为模板，使用反转录酶和0ligo(dT)18引物，合成cDNA第一链，根据普洛麦格生物技术有限公司反转录酶的使用说明书进行实验操作，通过反转录反应获得香菇cDNA。
[0030]3)香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因的全长cDNA克隆。根据鉴定的香菇基因组中半胱氨酰亚砜裂解酶基因序列设计引物(带有Nhe I和Xho頂每切位点)如下:
[0031]Csl-Nhe I 5’-CTAGCTAGC ATGTCCAATACACAATCCATCGCGC-3’
[0032]Csl-Xho I 5’_CCGCTCGAG TCAAGGCCTAATGGAAGCAAGCTGC-3'
[0033]PCR 反应程序:94°C 预变性 5min ； 94°C 变性 30s，62°C 退火 30s，72°C 延伸 2min，30 个循环;72°C最后延伸lOmin ；应用1 %琼脂糖凝聚电泳检测PCR产物，结果如图1所示。目标DNA片段大小为1500bp左右，与目的基因片段长度一致。经测序公司测序，得到香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因序列，长度为1494bp(SEQ ID从).1所示)。
[0034]实施例2:
[0035]香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因在制备香菇半胱氨酰亚砜裂解酶重组蛋白中的应用:
[0036]l)PMD18-T_Csl质粒的构建:应用北京百泰克DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒对半胱氨酰亚砜裂解酶基因的全长c