一种同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病毒诊断技术领域，尤其涉及一种同步检测CYVCV、CTV和CTLV的 三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒。
【背景技术】
[0002] 柑橘是世界第一大水果和全球第五大贸易农产品。2013年，我国柑橘栽培面积 3633万亩，产量3321万吨，均居世界第一位。近年来，随着柑橘产业的快速发展，柑橘发生多 病原混合感染及继发感染的情况越来越普遍。柑橘黄脉病毒、柑橘衰退病毒及柑橘碎叶病 毒这三种病毒在生产上流行范围广、为害较大，且存在混合侵染的情况，对我国柑橘产业安 全构成威胁。柑橘黄化脉明病毒引起的柑橘黄脉病是新近发生的一种病害。柠檬和酸橙感 染CYVCV后，树势减弱、产量降低，严重影响其经济价值。自2009年在我国云南瑞丽首次发现 以来，柑橘黄脉病在四川安岳、重庆等地也有发生，对部分地区的柠檬产业产生了比较严重 的影响。CYVCV是α线性病毒科(Alphaf lexiviridae)印度柑橘病毒属(Mandarivirus)病毒， 除可接传播，还可能通过粉虱和蚜虫传播，因而具有大面积传播流行风险，对柑橘产业尤其 是柠檬产业构成严重威胁。柑橘衰退病毒引起的柑橘衰退病是世界范围内一种极具经济重 要性的病害，对世界柑橘产业造成过严重为害，目前依然威胁着以酸橙为砧的柑橘和对CTV 茎陷点型株系敏感的葡萄柚、柚和甜橙的生产。虽然我国生产中多用抗病或耐病砧木，但广 泛分布着CTV的各种强毒株和强力传媒褐色桔蚜，随甜橙等的大发展，CTV茎陷点型强株系 的为害日趋严重。柑橘碎叶病毒引起的柑橘碎叶病是威胁柑橘生产的重要病害之一。现已 报道发生柑橘碎叶病的国家有日本、美国、南非、澳大利亚和中国，其中以中国和日本发生 最为普遍。CTLV在我国的浙江、湖南、福建和广西等地的局部地区已造成比较严重的为害。 目前，用于上述单一病毒检测的方法较多，例如指示植物检测鉴定、电镜观察、酶联免疫 (ELISA)、直接组织点免疫(DTBIA)，分子探针杂交等技术，并在生产中得到推广应用。随着 分子生物学的发展，RT-PCR检测方法以其速度快、灵敏度高、特异性好等特点受到青睐。巢 式RT-PCR，免疫捕获RT-PCR等则进一步提高了检测灵敏度或便捷性。
[0003] 但是，生物学检测方法如指示植物鉴定耗时长且受环境等诸多条件限制，费时费 力；血清学方法尤其DTBIA，操作简便，成本低廉，适合田间样品大规模检测，但其灵敏度及 准确性有待提高;分子生物学方法如RT-qPCR检测法快速、灵敏、特异，是目前采用的主要检 测方法之一，但也存在需要多次分病毒繁琐操作，时间成本高，污染几率较大，并且需要接 触有毒物质。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒，旨在解决 生物学检测方法受环境条件限制，费时费力;血清学方法灵敏度及准确性较低;分子生物学 方法存在需要多次分病毒繁琐操作，时间成本高，污染几率较大，需要接触有毒物质的问 题;并进一步提高检测灵敏度。
[0005] 本发明是这样实现的，一种同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒，所述同步检 测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒对CYVCV、CTV、CTLV三种病毒的特异引物同管混合包装， CYVCV、CTV、CTLV三种病毒上下游引物浓度分别为：CYVCV1.3yM、CTVl. 0yM、CTLV2.7μΜ; CYVCV、CTV、CTLV三种病毒扩增产物特征Tm值范围：CYVCV为86.25 ± 0.35°C、CTLV为84.00 土 0.25。(3、(：17为81.25±0.25。(3;
[0006] CYVCV、CTV、CTLV三种病毒特异性RT-qPCR引物序列如下：
[0007] CYVCV-F：TCAAACCTCCAACGCACAAAC；
[0008] CYVCV-R：CATTGTTGTGGGTTTTTGCTTC；
[0009] CTV-F：GTGTGCAGATTTCTTGACCG；
[0010] CTV-R：TCCCAAGCTGCCTGACATT；
[0011] CTLV-F：AGTTTGGAAGACGTGCTTCA；
[0012] CTLV-R：TGCAGAGAAGAAGGTAAAGCTC 〇
[0013] 进一步，所述同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒还包括:RT-qPCR反应液、 RT-Taq酶、阳性对照品、阴性对照品、标准品和无核酸超纯水。
[0014] 进一步，所述荧光定量RT-qPCR反应液包含荧光染料EvaGreen、氯化镁和三磷酸脱 氧核糖核苷酸。
[0015] 进一步，所述阳性对照品为:含CYVCV、CTV和CTLV片段重组质粒混合品，浓度均为 200ng/yl〇
[0016] 进一步，所述阴性对照品为:健康柑橘叶片总核酸提取液。
[0017] 进一步，所述定量RT-qPCR标准品由以下3种标准品组成：CYVCV标准品、CTV标准 品、CTLV标准品。
[0018] 进一步，所述同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒避光保存于-20度。
[0019]本发明的另一目的在于提供一种同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒的使用 方法，所述使用方法包括：
[0020]样品总核酸提取：使用常规方法或核酸抽提试剂盒从待测样品叶片中提取总核 酸，即可作为RT-qPCR模板；
[0021] 一步法多重实时荧光RT-qPCR:分别取2 . ΟμL模板、阳性对照品、阴性对照品，依次 加入RT-qPCR反应液12.5μ1，RT-Taq酶0.3μ1，CYVCV、CTV和CTLV特异性引物混合物1.5μ1，加 ddH20 至反应体系总体积为 25μ1;反应参数为：45°C30min; 95°C5min; 95°C 15s，60°Clmin，40 个循环;熔解曲线程序为95°C15s，60°Clmin，95°C15s;从60°C开始收集荧光信号；
[0022 ]标准曲线制作:分别取CYVCV、CTV和CTLV标准品用无菌双蒸水进行10倍梯度系列 稀释至1 X ΙΟ*3~1 X 107CopiesAU，然后采用上述方法进行实时荧光定量RT-qPCR反应，扩增 完成后，以Ct值为纵坐标，l 〇g1QX为横坐标，制作标准曲线；
[0023]结果判断：在正负对照均符合预期的前提下，通过熔解曲线峰值高低及有无来判 定检测样品是否为阳性，如果溶解曲线CYVCV、CTLV和CTV对应的Tm值处产生特异熔解峰，即 CYVCV为86.25 ± 0.35°C、CTLV为84.00 ± 0.25°C、CTV为81.25 ± 0.25°C，则相应病毒为检测 阳性，即待测样品携带相应病毒，反之，则为检测阴性，即没有携带相应病毒;如果检测结果 为阳性，根据所获得的标准曲线及待测样品Ct值，计算待测样本病毒浓度。
[0024] 本发明运用实时荧光定量RT-qPCR技术，采用CYVCV、CTLV和CTV的特异性引物，开 发出一种同步检测柑橘黄脉病毒、柑橘衰退病毒及柑橘碎叶病毒的一步法同步检测三种柑 橘病毒的RT-qPCR试剂盒。本发明通过一个RT-qPCR反应可以从样本中同时检测出CYVCV、 CTLV和CTV的存在，并且能够对待检测病毒进行准确定量。与传统的普通RT-qPCR相比，本发 明提升了 CYVCV、CTLV和CTV检测灵敏度100倍以上;仅需一个步骤完成检测，操作更简便并 可以减少污染导致假阳性几率30%;不必单独逆转录及电泳，省时3倍以上;在诊断病害发 生和监控病害流行及维护柑橘产业安全等方面具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0025]图1是本发明实施例提供的同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒使用方法流 程图。
[0026]图2是本发明实施例提供的三种病毒(CYVCV、CTLV和CTV)混合侵染柑橘样品进行 同步实时荧光定量RT-qPCR检测实例示意图。
[0027] 图3是本发明实施例提供的标准曲线及病毒定量示意图。
【具体实施方式】
[0028] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0029] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0030] 本发明实施例的同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒包括如下3对病毒特异 性RT-qPCR引物，其序列如下：
[0031] SEQ ID N0：1,CYVCV-F：TCAAACCTCCAACGCACAAAC；
[0032] SEQ ID NO：2,CYVCV-R：CATTGTTGTGGGTTTTTGCTTC；
[0033] SEQ ID NO：3,CTV-F：GTGTGCAGATTTCTTGACCG；
[0034] SEQ ID NO：4,CTV-R：TCCCAAGCTGCCTGACATT；
[0035] SEQ ID NO：5,CTLV-F：AGTTTGGAAGACGTGCTTCA；
[0036] SEQ ID NO：6,CTLV-R：TGCAGAGAAGAAGGTAAAGCTC〇
[0037] 所述试剂盒，CYVCV、CTV、CTLV三种病毒的特异引物同管混合包装，各病毒上下游 引物浓度为:CYVCV1.3yM、CTVl. 0yM、CTLV2.7μΜ。
[0038] 所述试剂盒，各病毒扩增产物特征Tm值范围：CYVCV为86.25 ± 0.35°C、CTLV为 84.00±0.25。(3、(：17为81.25±0.25。(3。
[0039] 所述试剂盒还包括:a)RT_qPCR反应液、b)阳性对照品、c)阴性对照品、d)标准品、 e) RT-Taq酶和f)无核酸超纯水。