一种与特发性无精子症相关的遗传标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及男性不育症检测领域,尤其涉及一种与特发性无精子症相关的遗传标 记。
【背景技术】
[0002] 全球约有10%~15%的育龄夫妇面临不能生育的问题,其中一半是由于男性不 育。原发性无精子症是造成男性不育的一个非常重要的原因,约影响1%的成年男性。男性 不育发病因素具有复杂性和多样性的特点,包括疾病、营养不良、内分泌紊乱、基因缺陷和 环境因素等,其具体发病机制尚不明确,但从家族病例报道和小鼠模型的研究成果中可以 推断遗传因素起了很大作用。近年来,随着现代分子生物学技术的发展,人们已发现近200 个基因与男性不育症的发生密切相关;采用基因敲除技术,发现近400个基因与小鼠精子 发生密切相关,这些基因的突变、缺失或表达异常,可能是男性不育症发生的重要原因。对 这些突变基因的研究将有助于男性不育症的诊断,也有助于将来在体外受精过程中防止将 遗传缺陷带给下一代。
[0003] 雄激素受体(AR,NCBI Gene ID:367)是一种重要的类固醇激素受体,在男性性分 化和维持正常精子发生过程中发挥关键作用。AR属于核转录因子调控的类固醇激素作用 的家族。AR有4个蛋白结构,包括N末端反式激活结构域(NTD),DNA结合域(DBD),铰链区 (HR)和羧基配体结合域(LBD)。它能结合雄激素,包括睾酮⑴和5 α -二氢睾酮(DHT)的 配体结合域,从而介导核易位和AR的转录调节功能。
[0004] 在过去的几年中,确定了一些AR突变或多态性,可以导致或与遗传疾病相关,如 完全或部分雄激素不敏感综合征(CAIS和PAIS)。然而,还需要深入地研究以揭示AR突变 与特发性无精子症(IA)的关系,为特发性无精子症的诊断提供依据和指导。
【发明内容】
[0005] 为了确定IA患者AR基因突变的情况,我们将776例IA患者和709例正常生育男 性的AR基因外显子测序,首次新发现5个错义突变和1个同义突变与IA的发生相关。
[0006] 基于本发明的发现,本发明提供一种与特发性无精子症相关的遗传标记,其位 于AR基因的编码区,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示,其中,上述序列的突变位点选自 c. 868T>C、c. 1484G>A、c. 1888C>T、c. 569C>T、c. 616A>G 和 c. 11490T 中的一个或多个。
[0007] 前5个突变位点是错义突变,第6个突变位点是同义突变。
[0008] 上述突变分别是在如SEQ ID NO: 1所示的AR基因序列的编码区的第868位、1484 位、1888 位、569 位、616 位、1279 位和 1149 位。
[0009] 前5个突变位点依次分别对应的氨基酸变化情况是p. C290R、p. S495N、p. R630W、 p. T190I和p. S206G,即第290位氨基酸由C变为R、第495位氨基酸由S变为N、第630位 氨基酸由R变为W、第190位氨基酸由T变为I、第206位氨基酸由S变为G。第6个突变位 点没有对应的氨基酸变化。
[0010] 作为本发明的优选方案,上述序列的突变位点选自c.868T>C、c. 1484G>A和 c. 1888C>T中的一个或多个。
[0011] 作为本发明的优选方案,上述序列的突变位点选自c. 18880T。
[0012] 通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了 AR基因的6个新的突变位点, 构建AR基因野生型及突变体表达质粒转染到细胞内进行研究,通过实验发现其功能有明 显差异,表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生,从而能够通过上述突变 来实现对男性不育症(尤其是特发性无精子症)的诊断检测。
【附图说明】
[0013] 图1为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点测序图谱;
[0014] 图2为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点影响的进化保守性的氨基酸;
[0015] 图3为在AR基因上发现的3个IA病人特异的错义突变的位置;
[0016] 图4为3个AR突变体对下游靶基因 MMTV表达的影响,NC表示阴性对照,WT表示 野生型。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0018] 1实验内容
[0019] 1.1标本的收集
[0020] 本申请人从2007年6月到2011年10月共收集1880例无精子症病人,其中特发 性无精子症病人为776例,我们的筛选标准为:1)随机检查三次精液中无精子;2)生殖系 统或盆腔无阻塞、炎症和损伤;3)无核型异常和Y染色体微缺失,另将709例正常可育男性 (至少育有一个孩子且未行IVF、ICSI、頂SI等人类辅助生殖技术)作为对照进行研究。每 例受试者均认真签署知情同意书,本次研究通过医院伦理委员会的审查批准。
[0021] 1.2外显子测序
[0022] 抽取外周血提取基因组DNA,用枸橼酸钠抗凝管收集研究对象的外周血,迅速置 于-80°C冰箱中备用,用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取外周血DNA。
[0023] 取出5微克基因组DNA送华大基因研究中心(深圳)进行外显子捕获、测序,在特 发性无精子症患者中筛选出AR基因中的9个突变位点中,其中7个错义突变和2个同义突 变,与dbSNP135数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库中的数据相比对,有5种错义突 变和1个同义突变是我们首次发现的新突变。
[0024] 1.3验证错义突变
[0025] 以提取的外周血基因组DNA为模板,使用设计合成的3对引物对仅在特发性无精 子症患者(W320, W691,W530)AR基因存在的3个错义突变位点(c. 868T>C、c. 1484G>A和 c. 1888C>T)进行特异性扩增,AR序列从NCBI数据库中查得(NCBI Gene ID:367)。引物由 Invitrogen公司合成,所合成的3对引物对见表1。
[0026] 表1AR突变位点验证引物
[0027]
[0029] PCR扩增条件为:98°C预变性 2min,然后以 98°C 10s、60°C 30s、72°C 45s 进行 35 个 循环,最后72°C延伸5min。
[0030] DNA电泳:取3 μ 1的PCR产物在1 %琼脂糖凝胶孔中,140V电泳,15min,紫外凝胶 成像系统拍照观察电泳图,确保单一条带,其余PCR产物送上海英潍捷基公司测序,引物对 Primerl、Primer2和Primer3扩增到的PCR产物片段序列分别如序列表中SEQ ID N0:8、 SEQIDN0:9和SEQIDN0:10所示。
[0031] 1. 4 AR突变体表达质粒的构建
[0032] 以 pcDNA3. l_AR(Mou L 等人,Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells. BiolReprod. 2013 Aug 15 ;89 (2) : 32.)为模 板,使用设计合成的3对点突变引物,构建AR的3种突变体表达质粒。引物由Invitrogen 公司合成,所合成的3对点突变引物见表2。
[0033] 表2 AR 3对定点突变引物
[0034]
[0035] 1· 5双荧光素酶报告基因实验
[0036] 1. 5. 1质粒准备
[0037] 野生型 AR 表达载体:pcDNA3· 1-AR WT (WT 组)
[0038] 突变型 AR 表达载体:pcDNA3· 1-AR C29〇R (C29〇R 组)
[0039] pcDNA3. 1-AR S495N(S495N 组)
[0040] pcDNA3. 1-AR R630W(R630W 组)
[0041] 1. 5. 2 HeLa 细胞培养
[0042] 将HeLa细胞用含10%胎牛血清DMEM培养基在37°C、5% 0)2和95%湿度条件下 培养。贴壁细胞在长满瓶底时,用〇. 25%胰蛋白酶消化后按比例进行传代培养。
[0043] 1. 5. 3 HeLa细胞瞬时转染
[0044] 将HeLa细胞接种于24孔板,待细胞贴壁后进行转染,方法参考转染试剂 Lipofectamine? 2000说明书。转染6h后,用移液枪吸弃每孔培养液,每孔再加入新的1640 培养基500 μ 1,减少Lipofectamine? 2000对细胞的毒性。
[0045] 1. 5. 4双荧光素酶报告系统检测转录因子活性
[0046] 1)转染24h后收集细胞,用移液枪吸弃每孔培养液,每孔加入PBS 1ml洗涤2次;